分光光度法测定牛乳中亚硝酸盐含量的不确定度评定

杨美丰，纪坤发，何 瑛，杨爱君

广东燕塘乳业股份有限公司，广东广州 511356

0 引言

牛乳含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素以及矿物质等营养元素，不但可以很好地维持人体的健康水平，而且在预防各种慢性疾病方面也有一定地食疗作用[1，2]，深受消费者的喜爱。

但牛乳的质量安全问题也一直是消费者关注的焦点。一般情况下，牛乳中会含有微量的亚硝酸盐，其可被人体正常代谢而不会产生伤害。但在奶牛场水质、饲料、环境受到污染的情况下，牛乳中的亚硝酸盐含量会出现超标问题。超标的亚硝酸盐可能会使人体内的血红蛋白发生异常而损害人体健康，甚至会在体内转换成致癌性的亚硝胺[3]。因此，牛乳中亚硝酸盐含量的准确检测极其重要。

本试验通过《GB 5009.33—2016 食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[1]中的第二法分光光度法对乳中亚硝酸盐含量进行测定，并参照《JJF 1059.1—2012 测量不确定度评定与表示》[4]和《CNAS-CL006-2019 化学分析中不确定度的评估指南》[5]的要求对试验过程中的不确定度进行分析，得到试验过程中测量不确定度的主要来源，为日常检测牛乳中亚硝酸盐含量的不确定度评定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 样品

生乳：来自广东、福建、甘肃等地的奶牛场。

1.1.2 试验试剂

亚硝酸钠溶液标准物质（200 μg/mL），北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；亚铁氰化钾溶液（150 g/L)、乙酸锌溶液（220 g/L）、饱和硼砂溶液（50 g/L）、盐酸（20%），广州化学试剂厂；对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）、盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L），国药集团化学试剂有限公司；水为一级水。

1.1.3 标准物质配制

亚硝酸钠标准储备液（40 mg/L）：吸取10 mL亚硝酸钠溶液标准物质于50 mL容量瓶，用水定容，混匀后放于4 ℃避光保存。

亚硝酸钠标准使用液（5 mg/L）：吸取亚硝酸钠标准储备液3.125 mL于25 mL容量瓶，用水定容，摇匀。

1.1.4 仪器设备

紫外可见分光光度计(UV-1800)，岛津中国；冷冻离心机，德国Sigma公司；电磁炉，九阳股份有限公司；振荡水浴箱，德国Julabo公司；电冰箱，西门子公司；超纯水系统，德国Millipore公司；移液器、容量瓶，德国Brand公司；涡旋振荡器，广州海太公司。

1.2 方法

1.2.1 样品提取

吸取样品18 mL放于50 mL离心管，加入饱和硼砂溶液2.5 mL，涡旋振荡器混匀后再加入70 ℃左右的水12 mL，继续混匀后在95 ℃水中加热15 min，取出放置至室温后加入亚铁氰化钾溶液1 mL，摇匀，再加入乙酸锌溶液1 mL，摇匀，以沉淀蛋白质，最后加5.5 mL水定容至40 mL。放置沉淀2 h后离心（9 000 r/min，3 min），过滤，滤液备用。

1.2.2 测定

吸取4 mL样品于10 mL比色管，另外吸取15 μL、30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150μL、180 μL亚硝酸钠标准使用液于10 mL比色管，相当于0.075 μg、0.15 μg、0.3 μg、0.45 μg、0.6 μg、0.75 μg、0.9 μg亚硝酸钠，加入对氨基苯磺酸溶液0.6 mL，在涡旋振荡器上混匀后静置3～5 min，再加入盐酸萘乙二胺溶液0.3 mL，加水定容至10 mL刻度线，再次摇匀匀，静置15 min用零号管调节零点，于538 nm的波长测定吸光度，绘制的标准曲线作比较，同时做试剂空白。

2 结果与分析

2.1 数学模型和测量不确定度来源分析

2.1.1 数学模型

根据GB 5009.33—2016[6]中的第二法分光度度法计算亚硝酸盐（以NaNa2计）含量的公式，可得出评定牛乳中亚硝酸钠含量的测量不确定度的数学模型为:

公式中：X为样品中亚硝酸钠含量，mg/kg；C为曲线得出亚硝酸盐的浓度，mg/L；m为样品质量（18 mL×ρ样品），g；V0-试样处理液总体积，40 mL；V1-测定样液定容体积，10 mL；V2-测定样液体积，4 mL；1000为换算系数。

2.1.2 测量不确定度来源分析

根据亚硝酸盐含量的检测步骤及输入量的函数关系可以发现，测量不确定度分量主要来源为：（1）紫外分光光度计引入的不确定度；（2）取样量引入的不确定度；（3）试样处理液总体积引入的不确定度；（4）测定样液定容体积引入的不确定度；（5）测定样液体积引入的不确定度；（6）制备标准工作液引入的不确定度；（7）样品重复性引入的不确定度。

亚硝酸盐含量的测量不确定度分类见表1和不确定度因果关系见图1。

表1 亚硝酸盐含量的测量不确定度来源及分类

图1 测量不确定因果关系图

2.2 亚硝酸盐含量测量不确定度分量的量化

2.2.1 紫外可见分光光度计影响因子的不确定度

样品经前处理提取离心定容后，使用紫外可见分光光度计在538 nm波长处进行测定时，所用仪器的的稳定性、灵敏度等会影响测量结果的不确定度，根据紫外可见分光光度计校准证书（校准证书编号NW202105138）中给出U=0.4 nm，k=2，可以计算出仪器的标准不确定度u为：

将紫外可见分光光度计影响因子分量转化为相对标准不确定度urelnm()为：

2.2.2 吸样量的不确定度

由制造商提供的10 mL可调移液器校准证书（校准证书编号BSH-CL-2020080029-5）中标明其容量相对误差测量结果扩展不确定度（k=2）为5 μL，因此10 mL可调移液器的标准不确定度为：

18 mL的样品分两次吸取，即吸样量引入的相对标准不确定度为：

2.2.3 试样处理液总体积的不确定度

吸取样品18 mL放于50 mL离心管，加入饱和硼砂溶液2.5 mL，涡旋振荡器混匀后再加入70 ℃左右的水12 mL，继续混匀后在95 ℃水中加热15 min，取出放置至室温后加入亚铁氰化钾溶液1 mL，摇匀，再加入乙酸锌溶液1 mL，摇匀，以沉淀蛋白质，最后加5.5 mL水定容至40 mL。

2.2.3.1 由2.2.2中可知urelm()=0.00039

2.2.3.2 由制造商提供的5 mL可调移液器校准证书（校准证书编号BSH-CL-2020080029-4）中标明其容量相对误差测量结果扩展不确定度（k=2）为4.3 μL，其标准不确定度为

5 mL可调移液器引入的相对标准不确定为：

2.2.3.3 由制造商提供的A级25 mL分度吸量管校准证书（校准证书编BSH-CL-2020070020-1M）中标明其容量相对误差测量结果扩展不确定度（k=2）为0.02 mL，因此25 mL分度吸量管的标准不确定度为：

即25 mL分度吸量管相对标准不确定度为：

2.2.3.4 由制造商提供的1 mL可调移液器校准证书（校准证书编号BSH-CL-2020080029-3）标明其容量相对误差测量结果扩展不确定度（k=2）为1.3 μL，其标准不确定度为

由于加亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液时使用了2次1 mL可调移液器，因此1 mL可调移液器引入的相对标准不确定为：

2.2.3.5 由2.2.2可知10 mL可调移液器的标准不确定度u=2.5µL ，其引入的相对标准不确定为：

2.2.3.6 合成上述五项相对标准不确定度，可得试样处理液总体积的相对标准不确定度

2.2.4 测定样液定容体积的不确定度

①校准引入的不确定度：根据《JJG 10—2005 专用玻璃量器检定规程》[7]，10 mL比色管容量允许误差为±0.10 mL，按照矩形分布可得10 mL比色管校准产生的标准不确定度为

②温度引入的不确定度：玻璃器皿校准时的温度为20 ℃，而试验室的温度控制在（20±4）℃之间，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃[8]，玻璃的膨胀系数忽略不计，按照矩形分布可得标准不确定度：

合成上述2项不确定度分量，则测定样液定容体积的标准不确定度

因此，10 mL比色管的相对标准不确定度为：

2.2.5 测定样液体积的不确定度

由2.2.3.2中可知5 mL可调移液器的标准不确定度u=2.15µL，其相对标准不确定为：

2.2.6 制备标准工作溶液的不确定度

2.2.6.1 标准物质溶液引入的不确定度

试验中所用的亚硝酸钠溶液标准物质浓度为200 μg/mL，由北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司提供，GBW（E）100156国家标准物质证书，批号为84G1，证书上标明食品检测用亚硝酸钠溶液标准物质的相对扩展不确定度（k=2）为2%，则相对标准不确定为

2.2.6.2 稀释配制过程容量瓶引入的不确定度

25 mL容量瓶（A级）和50 mL容量瓶（A级）引入的不确定度，其有校准和温度两种影响因素

①校准：由制造商提供的25 mL容量瓶（A级）和50 mL容量瓶（A级）校准证书（校准证书编号BSH-CL-2020070020-3）中标明其在20 ℃下的扩展不确定度（k=2）都为U=0.02 mL，按照矩形分布，计算其标准不确定度

②温度：根据证书信息，该容量瓶在20 ℃校准，而试验室的温度控制在（20±4）℃之间，根据JJG 196—2006规定，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃[8]，按照矩形分布可得25 mL容量瓶和50 mL容量瓶的标准不确定度分别为：

由上述两种分量可得使用25 mL容量瓶和50 mL容量瓶时引入的标准不确定度分别为：

因此，25 mL容量瓶和50 mL容量瓶的相对标准不确定度分别为：

2.2.6.3 稀释配制过程移液器引入的不确定度

由2.2.2可知10 mL可调移液器的标准不确定度为u10mL移=2.5µL ，其相对标准不确定度为:

由2.2.3.2可得5 mL可调移液器的标准不确定度为u5mL移=2.15µL ，其相对标准不确定度为:

由 制 造 商 提 供 的1 0 0 μ L和2 0 0 μ L可调移液器校准证书（校准证书编号B S HC L-2 0 2 0 0 8 0 0 2 9-1和校准证书编号B S HCL-2020080029-2）标明容量相对误差测量结果扩展不确定度（k=2）分别为0.09 μL和0.40 μL，其标准不确定度分别为

表2 可调移液器引入的相对标准不确定度

2.2.6.4 稀释配制过程比色管引入的不确定度

由2.2.4可知10 mL比色管的相对标准不确定度为 urelV1()=0.0058

2.2.6.5 配制标准储备液引入的不确定度

用10 mL可调移液器吸取10 mL 200 μg/mL亚硝酸钠溶液标准物质于50 mL容量瓶（A级），用水定容，混匀后可得40 mg/L亚硝酸钠标准储备液，则40 mg/L亚硝酸钠标准储备液的相对标准不确定度：

2.2.6.6 配制标准使用液引入的不确定度

用5 mL可调移液器吸取3.125 mL 200 μg/mL亚硝酸钠标准储备液于25 mL容量瓶（A级），用水定容，混匀后可得5 mg/L亚硝酸钠标准使用液，则5 mg/L亚硝酸盐标准使用液的相对标准不确定度：

2.2.6.7 配制标准工作溶液引入的不确定度

用100 μL和200 μL可调移液器分别移取15 μL、30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL、180 μL亚硝酸钠标准使用液于10 mL比色管，相当于0.0075 mg/L、0.015 mg/L、0.030 mg/L、0.045 mg/L、0.060 mg/L、0.075 mg/L、0.090 mg/L亚硝酸钠。则0.0075 mg/L、0.015 mg/L、0.030 mg/L、0.045 mg/L、0.060 mg/L、0.075 mg/L、0.090 mg/L的亚硝酸钠标准曲线系列点的相对标准不确定度分别见公式1。

综上所述，标准工作溶液引入的不确定度由标准工作溶液各个系列点的相对标准不确定度方根求得，即：

2.2.7 样品重复性的不确定度

将同一份生乳样品做6个平行样进行重复性测定，试验所得回归方程为y=0.7948x-0.0005，相关系数R2为0.99994。计算出生乳中亚硝酸钠的平均含量及标准偏差，结果如下表3所示：

表3 乳中亚硝酸钠的重复性试验（n=6）

所以重复性（Rep）引入的相对标准不确定度为：

2.3 合成相对标准不确定度

该方法测定牛乳中亚硝酸盐含量的不确定度来源汇总如表4所示。

表4 牛乳中亚硝酸盐含量的不确定度来源汇总

合成的相对标准不确定度为：

即标准不确定度为：

2.4 亚硝酸盐含量扩展不确定度

分光光度法测定牛乳中亚硝酸盐含量的扩展不确定度，当取置信度为95%，包含因子为k=2时，扩展不确定度为

3 结论

分光光度计测定牛乳中亚硝酸盐含量的测量不确定度报告，取置信度为95%，包含因子k=2时，报告结果为

通过此次分光光度法测定牛乳中亚硝酸盐含量的不确定度评定分析可得，检测结果的不确定度来源最主要是标准工作溶液引入的不确定度，试样处理液总体积、测定样液定容体积和样品重复性的影响次之，而仪器影响因子、样品取样量和测定样液体积带来的影响与前几者相比，可以忽略不计。因此，在使用分光光度计测定牛乳中亚硝酸盐时，需使用有证标准物，可增加平行样的测定次数，使用精密度更高的玻璃器皿，试验设备也需要定时计量，减少不确定度，提高检测结果的准确度。