维生素D联合阿司咪唑对肝癌细胞的抑制作用及其机制

徐俊丽 陈昳菲 李雅睿 郭丹 王如画

(1西安市第一医院,陕西 西安 710000;2西安交通大学第一附属医院)

手术治疗对于早期发现的肝癌治疗效果好〔1〕。研究证实肝癌术后有较高的复发和肝内转移率，肝癌根治性切除术后5年的复发率高达80%〔2，3〕。由此肝癌的靶向治疗随着分子生物学的发展受到了越来越多的关注，寻找有效的抗肿瘤药物及其作用靶点至关重要。维生素D(VD)代谢的调节对于人体生理学是关键的，它通过VD受体(VDR)调节钙稳态相关的基因表达。此外，VD是一种重要的内源性抗癌剂，因为它可抑制细胞增殖，获得更加分化的表型并诱导细胞凋亡〔4，5〕。Eag1是EAG K+通道家族的成员，在VD的抗肿瘤作用中，Eag1表达对细胞的生长抑制起重要作用〔6～8〕。VD吸收入血后在肝脏和肾脏进行代谢，肾脏中的一个关键酶是 24-羟化酶(CYP24A1)，主要起到降解骨化三醇的作用〔9〕，它的表达同时也受到骨化三醇与VDR的结合及与CYP24A1启动子中存在的VD应答元件(VDRE)的进一步相互作用而直接调节〔10〕。而阿司咪唑是一种通过特定通道对K+电流的功能性阻断，来达到对Eag1的抑制作用〔11，12〕。研究表明，在乳腺癌、宫颈癌及神经细胞瘤等研究中，阿司咪唑通过影响细胞K+通道可发挥其肿瘤细胞的增殖抑制作用〔13～15〕。但是阿司咪唑对于VD是否有药代动力学的作用，在肝癌中尚未得到证明，本研究旨在探讨VD联合抗组胺药物对于肝癌细胞的作用，并对其分子机制进行阐述。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人肝癌细胞系HepG2、Huh7获自中国科学院上海细胞库。

1.1.2主要试剂和药物 DMEM/High Glucose培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自HyClone公司；KCNH-1抗体购于Abcam公司；VDR抗体购自Wanleibio公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG购自北京天德悦生物科技有限公司；常规生物化学试剂购自西安赫特生物公司；VD3、阿司咪唑购自Solarbio公司。

1.2药品配制 将10 mg VD3溶于10 ml无水乙醇中，分装后避光4℃保存。将50 mg阿司咪唑溶于11 ml无水乙醇中，分装后避光4℃保存。

1.3细胞培养 将肝癌细胞HepG2、Huh7在含有10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的DMEM中培养。将其保持在37℃，5%CO2湿润的培养箱中。取对数生长期细胞进行实验。每个浓度设5个复孔，实验重复3次。

1.4Western印迹 分别收集阴性对照组、1 μmol/L的VD3、5 μmol/L的阿司咪唑、VD3和阿司咪唑双重干预72 h的HepG2、Huh7细胞，提取蛋白，Bradford法测定蛋白含量，制备Western上样样品，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；将电泳分离的蛋白电转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)封闭PVDF膜1 h；加VDR一抗(1∶500，含5%脱脂奶粉的TBST稀释)、Eag-1一抗(1∶1 000，含5%脱脂奶粉的TBST稀释)4℃孵育过夜，TBST充分洗涤PVDF膜3次，每次10 min；加HRP标记羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG(1∶5 000，3%牛血清白蛋白TBST稀释)孵育1 h，TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min；内参使用GAPDH(鼠抗人，稀释度1∶1 000)。电化学发光(ECL)，X线胶片曝光，凝胶成像系统扫描，以目的条带与GAPDH条带灰度值的比值代表蛋白的表达水平。

1.5qRT-聚合酶链反应(PCR) 分别收集阴性对照组、1 μmol/L的VD3、5 μmol/L的阿司咪唑、VD3和阿司咪唑双重干预72 h的HepG2、Huh7细胞，利用Trizol进行RNA提取，然后进行逆转录的操作，具体方法参照试剂盒说明书进行。进行qRT-PCR检测时，以actin为内参。VDR基因引物序列：正义链：5′-TCTCCAATCTGGATCTGAGTGAA-3′，反义链：5′-GGATGCTGTAACTGACCAGGT-3′；CYP24-A1基因引物序列：正义链：5′-GATTTTCCGCATGAAGTTGGGT-3′，反义链：5′-CCTTCCACGGTTTGATCTCCA-3′。反应体系：2.0 μl cDNA，8.5 μl超纯水，上下游引物各1.0 μl，SYBR Green 12.5 μl，共计25 μl。反应条件：①预变性95℃，10 min；②变性：95℃，15 s；③退火/延伸：60℃，1 min，循环35～40次。

1.6四甲基偶氮唑蓝(MTT) 将HepG2和Huh7细胞以(3～5)×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，培养基中加入各组药物。培养24、48、72、96 h后，随后将细胞在含有0.5 mg/ml MTT的培养基中培养，并在黑暗中保持4 h。 除去上清液后，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)。 通过EnSpire Multimode Plate Reader测量490 nm处的光密度(OD)来测定细胞活力。按照公式：细胞存活率=实验组吸光值/阳性对照吸光值×100%。为提高实验结果的准确性，每组设置5个复孔。与实验平行，加细胞、培养基不加抑制剂的组为阳性对照组。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、χ2检验和Fisher精确检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1VD联合阿司咪唑对肝癌细胞增殖的影响 与阴性对照组相比，24 h后VD和阿司咪唑可抑制肝癌细胞增殖，VD联合阿司咪唑组对肝癌细胞增殖的抑制最明显(均P<0.05)。见表1。

2.2VD联合阿司咪唑对肝癌细胞中VDR、Eag-1及CYP24A1 mRNA的表达影响 VD组、阿司咪唑组和VD联合阿司咪唑组VDR mRNA均显著高于阴性对照组，VD联合阿司咪唑组显著高于VD组及阿司咪唑组(均P<0.05)；VD组、阿司咪唑组、VD+阿司咪唑组CYP24A1、Eag-1 mRNA均显著低于阴性对照组，VD联合阿司咪唑组显著低于VD组及阿司咪唑组(P<0.05)。见表2。

2.3VD联合阿司咪唑对肝癌细胞中Eag-1及VDR蛋白表达的影响 不同干预处理肝癌HepG2、Huh7细胞72 h后，各组Eag-1/GAPDH比较：阴性对照组最高，其次为VD组和阿司咪唑组，VD组+阿司咪唑组最低，差异均有统计学意义(P<0.05)。各组VDR/GAPDH比较：阴性对照组最低，其次为VD组和阿司咪唑组，VD+阿司咪唑组最高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

表1 不同干预对肝癌HepG2、Huh7细胞增殖的影响

表2 各组肝癌HepG2细胞VDR、CYP24A1、Eag-1 mRNA的表达及Eag-1/GAPDH、VDR/GAPDH的灰度比值

1～4：阴性对照组；VD组；阿司咪唑组；VD联合阿司咪唑组图1 不同干预处理肝癌HepG2、Huh7细胞72 h后对Eag-1、VDR蛋白表达的影响

3 讨 论

VD已在体内和体外显示出显著的抗肿瘤作用〔3，16〕。致癌因子Eag1作为VD的靶点，同时又被阿司咪唑阻断活性〔17〕，研究报道高VDR和Eag1表达是肝癌肿瘤的特征〔7〕。本研究结果表明，阿司咪唑能够通过涉及CYP24A1下调和VDR表达上调的机制增强VD的抗肿瘤增殖作用，提示阿司咪唑能够改善VD的生物学效应。此外，阿司咪唑和VD均下调Eag1基因的表达，再加上阿司咪唑对Eag1通道活性的功能性阻断〔8〕，可进一步解释联合治疗的高效抗增殖作用。本研究结果表明，阿司咪唑可以改变VD的药代动力学，并暗示可以将VD与阿司咪唑组合用于未来的研究。本研究结果证实，当在阿司咪唑存在共培养时，VD增加其在表达VDR和Eag1基因细胞中的抗增殖活性。这种效应很可能是由于阿司咪唑依赖性VDR上调和CYP24A1识失活；Eag1表达和活性的抑制也同理。