肿瘤组织Ki67的表达与肝细胞癌肝移植患者预后的关系

陈池义，张炜琪，谢炎，蒋文涛

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是癌症相关死亡的主要原因之一［1］。肝移植（liver transplantation，LT）是治疗HCC最有效的手段之一。有文献报道，符合米兰标准的HCC患者LT术后5年生存率可达70%［2-3］。即便如此，仍有15%～20%符合米兰标准的患者术后会出现肿瘤复发，严重影响患者预后［4-5］。因此，临床需要可靠的指标来反映患者的预后情况。Ki67是一种肿瘤增殖相关核蛋白，被认为是细胞增殖的敏感标志物，反映恶性肿瘤细胞的比例，与肿瘤的进展和转移密切相关［6-7］。但有关Ki67的表达与肝癌肝移植患者预后关系的研究较少。本研究旨在探讨肿瘤组织Ki67的表达与HCC患者LT术后预后的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2014年7月—2018年6月于天津市第一中心医院接受原位肝移植的178例HCC患者的临床资料。所有HCC患者均经术后病理诊断，且术前影像学检查均排除大血管侵犯和远处转移。178例患者中，男156例，女22例，平均年龄（54.24±9.37）岁。纳入标准：（1）首次原位肝移植。（2）≥18岁的成年患者。（3）肿瘤无远处转移及大血管侵犯。（4）病理学检查证实为HCC。排除标准：（1）多器官联合移植。（2）混合性肝癌。（3）术前合并其他部位的肿瘤。（4）临床及病理资料缺失。本研究经天津市第一中心医院医学伦理委员会批准通过（伦理号：2021N077KY）。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集 收集患者术前资料包括年龄、性别、终末期肝病模型（model for end liver disease，MELD）评分、白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）、血红蛋白（HGB）水平、国际标准化比值（INR）、凝血酶原时间（PT）、血甲胎蛋白（AFP）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆红素（TB）、白蛋白（ALB）水平，肿瘤个数和最大直径，是否存在卫星灶，是否存在微血管侵犯，肿瘤分化程度以及肿瘤组织Ki67标签指数（Ki67 labeling index，KLI）。所有资料均源自天津市第一中心医院病历系统，相关实验室和病理检查由本院检验科和病理科完成。

1.2.2 肝移植手术与术后管理 所有患者均接受原位肝移植术，供肝均来源于中国公民逝世后器官捐献。术后初始免疫抑制方案均采用他克莫司+霉酚酸酯类药物+激素（药物剂量根据血药浓度调整）。

1.2.3 免疫组织化学染色 肿瘤标本石蜡病理切片，经二甲苯脱蜡后进行梯度乙醇水化，然后进行抗原修复，并以0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，再行山羊血清封闭。Ki67抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，1∶300）孵育4℃过夜。次日37℃复温1 h后，生物素标记二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）孵育30 min，链霉卵白素工作液37℃孵育30 min，最后使用DAB二氨基苯甲胺显色、冲洗、复染、脱水、透明、封片。在20个高倍视野（400倍）下随机计数1 000个肿瘤细胞，阳性细胞数占总计数的百分比即为KLI。

1.2.4 术后随访 患者出院后采用门诊或电话方式随访。术后2年内每2个月随访1次，此后每6个月随访1次。随访期间常规行影像学、生化以及肿瘤标志物检查。总生存时间（overall survival，OS）定义为LT至患者死亡的时间；对于中途失访者，则为LT至最后1次随访的时间。无复发生存时间（recurrence-free survival，RFS）定义为LT至肿瘤复发的时间；对于中途失访或死亡者，则为LT至最后1次随访的时间。

1.3 统计学方法 使用SPSS 25.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，非正态分布的计量资料以中位数和四分位数［M（P25，P75）］表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank检验比较生存率的差异。采用Cox比例风险回归进行单因素和多因素分析影响患者预后的危险因素。检验水准双侧α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果178例患者的KLI为1%～80%，中位数为20%，将患者分为Ki67高表达组（KLI＞20%，85例）和Ki67低表达组（KLI≤20%，93例），见图1。

Fig.1 The expression of Ki67 in liver cancer tissues detected by immunohistochemistry(×400)图1免疫组化检测Ki67在肝癌组织中的表达（×400）

2.2 Ki67的表达与HCC患者临床及病理特征的关系2组患者的年龄、性别、肿瘤个数、肿瘤最大直径、卫星灶、AST、ALT、TB、ALB、WBC、HGB、PLT、INR、PT以及MELD评分差异无统计学意义（P＞0.05），高表达组患者术前血清AFP水平、微血管侵犯以及低分化的比例均高于低表达组（P＜0.05），见表1。

2.3 Ki67的表达与患者预后的关系Ki67高表达组患者术后1、3、5年总体OS分别为78.7%、52.6%、39.5%，低于Ki67低表达组（86.5%、76.3%、76.3%），差异有统计学意义（Log-rankχ2=9.016，P＜0.01），见图2。高表达组患者1、3、5年RFS分别为47.9%、34.7%、32.0%，亦低于低表达组（84.4%、77.5%、72.4%）差异有统计学意义（Log-rankχ2=28.467，P＜0.01），见图3。

Tab.1 Comparison of clinicopathological data between the two groups表1 2组患者临床病理资料比较

Fig.2 Comparison of overall survival between two groups of patients after liver transplantation图2 2组患者肝移植术后OS比较

Fig.3 Comparison of recurrence-free survival between two groups of patients after liver transplantation图3 2组患者肝移植术后RFS比较

2.4 单因素及多因素Cox回归分析 变量赋值方法，见表2。单因素Cox回归分析结果显示，多个肿瘤、肿瘤最大直径＞5 cm、有卫星灶、有微血管侵犯、肿瘤低分化、术前血清AFP＞400 µg/L以及KLI＞20%是影响患者RFS的危险因素，见表3。其中多个肿瘤、肿瘤最大直径＞5 cm、有微血管侵犯、肿瘤低分化、术前血清AFP＞400µg/L以及KLI＞20%是影响患者OS的危险因素，见表4。

将单因素分析中差异有统计学意义的变量纳入多因素Cox回归分析，在纳入的7个变量中，肿瘤直径＞5 cm、有微血管侵犯、术前血清AFP＞400µg/L以及KLI＞20%是影响患者术后RFS的独立危险因素，见表5。在纳入的6个变量中，有微血管侵犯、术前血清AFP＞400 µg/L是影响患者OS的独立危险因素，见表6。

Tab.2 Variable assignment表2变量赋值情况

Tab.3 Univariate Cox regression analysis on recurrencefree survival of patients表3影响患者术后无复发生存的单因素Cox回归分析

Tab.4 Univariate Cox regression analysis on overall survival of patients表4影响患者术后生存的单因素Cox回归分析

Tab.5 Multivariate Cox regression analysis on recurrence-free survival of patients表5影响患者术后无复发生存的多因素Cox回归分析

Tab.6 Multivariate Cox regression analysis on overall survival of patients表6影响患者术后生存的多因素Cox回归分析

3 讨论

肿瘤的增殖状态是反映肿瘤生物学特性的重要参数，与肿瘤的治疗效果以及患者的预后直接相关［8］。Ki67蛋白存在于细胞周期的所有活跃阶段，可以有效反映细胞的增殖状态，因此它被认为与肿瘤的进展和转移有关［9-10］。多项研究发现，在前列腺癌［11］、肺癌［12］、食管癌［13］、胰腺癌［14］、星形细胞瘤［15］、胰腺内分泌肿瘤［16］以及垂体腺瘤［17］等多种癌症中，肿瘤组织Ki67高表达的患者预后往往较差。但关于Ki67的表达与HCC患者肝移植术后预后关系的研究较少。

已有文献报道，Ki67的表达与HCC的增殖和恶性生物学活性有关，并且Ki67高表达的肝癌易发生侵袭和转移［18］。国内学者研究发现，相比治愈组，Ki67在肝癌复发患者中的表达更高；Ki67的高表达与肝癌患者根治性切除术后复发以及较低的总体生存率相关［19-20］。张彦等［21］通过相关性分析发现，肝癌组织Ki67的表达与HCC患者的AFP水平以及门静脉转移相关，并且Ki67在正常肝组织及高、中、低分化组织中的表达强度呈增加趋势。Zhang等［18］也发现肝癌组织Ki67阳性与LT术后HCC复发相关，但没有给出用于区分Ki67表达高低的截断值。

本研究以患者KLI的中位数（20%）作为区分Ki67表达高低的截断值，结果发现，Ki67的表达与肝细胞癌肝移植患者的预后有关。高表达组患者的总体生存率和无复发生存率均低于低表达组。多因素分析显示，Ki67高表达是影响患者肝移植术后RFS的独立危险因素。同时，高表达组患者的术前血清AFP水平、微血管侵犯以及低分化的发生率要高于低表达组。与Ki67低表达的肿瘤相比，Ki67高表达的肿瘤往往增殖活跃，更容易对周围组织产生侵袭和转移［9-10］。韩帅等［22］发现Ki67的表达与HCC脉管癌栓、血清AFP水平、肿瘤分化程度以及复发有关。Luo等［23］的一项荟萃分析结果表明，Ki67高表达与肿瘤分化、转移以及静脉侵犯有关，并且Ki67高表达患者的总体生存率和无复发生存率较低。值得注意的是，在乳腺癌中，KLI≥20%也被认为是Ki67的高表达状态［24］。

总之，本研究表明Ki67高表达的肝癌肝移植患者预后较差，并且Ki67的表达与患者术前血清AFP水平、肿瘤分化以及微血管侵犯有关；肿瘤组织Ki67可以作为预测肝癌肝移植患者预后的一个潜在指标。考虑到本研究为单中心、回顾性研究，且样本量有限，因此结果可能具有一定的局限性，仍需进一步验证。