鸡源凝结芽孢杆菌的筛选鉴定及益生性能评价

代玉明，黄 涛，熊 涛

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330031)

益生菌是指达到一定数量能够对机体发挥益生作用的活体微生物，其中乳酸菌因具有优良的益生性能而在食品等诸多行业被广泛使用和研究[1]，但常见的乳酸菌如双歧杆菌、乳酸乳球菌等抗逆性差，在生产、运输和使用过程中容易出现效用下降的问题，所以益生性能优良且抗逆性强的乳酸菌菌种筛选是食品等行业需要长期关注和研究的课题。

近年来,“产芽孢的乳酸菌”——凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)凭借较高的抗逆性受到市场的青睐，且于2016年被卫健委列入《可用于食品的菌种名单》。凝结芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，端生或中生芽孢，能够利用葡萄糖、甘露醇等多种糖类生成乳酸，且产芽孢的特点赋予凝结芽孢杆菌对恶劣环境极强的抗逆性，如高温、强酸、高胆盐等[2]；凝结芽孢杆菌主要来源于动物粪便、土壤和传统发酵食品等。凝结芽孢杆菌不仅有传统乳酸菌调节肠道菌群、提高免疫力、抗氧化和降低胆固醇的能力[3-4]，而且具有储存运输稳定、不易染菌、易于培养等特点。目前，凝结芽孢杆菌制剂在食品工业、医疗、养殖业等行业普遍应用[5]。

筛选性能优良的凝结芽孢杆菌是其保证其产品质量的前提之一，所以对菌种的评价尤为重要。日前多数研究凝结芽孢杆菌的评价是多样化的，主要包括凝结芽孢杆菌生产和使用过程中对各种环境的耐受能力、特殊代谢产物的生产和代谢能力及其发酵产品对宿主肠道菌群的影响等[6]，对于凝结芽孢杆菌自身的胆固醇降解活性及抗氧化性方面研究较少。有研究表明,益生菌对胆固醇有一定的降解能力[7]，也可作为生物抗氧化剂，通过调节差异表达的蛋白质改变磷酸甘油激酶等多种酶类的表达水平以增强抗氧化活性[8-9]。由于益生菌的评价指标较复杂且有菌株特异性，很难进行综合对比，而有研究表明主成分分析法可以在损失较少原有信息的基础上巧妙地规避重复性数据的影响比较综合性能的强弱[10-11]。

本研究旨在从芦花鸡粪便中筛选并鉴定出凝结芽孢杆菌，针对芽孢杆菌的特性，评价其耐热能力和胃肠道耐受性，通过主成分分析法综合比较凝结芽孢杆菌抗逆性能，再通过比较菌株的产酸能力、胆固醇降解能力、抗氧化能力及安全性，获得既安全又具备较强益生性能的凝结芽孢杆菌，丰富现有菌种资源，为凝结芽孢杆菌在产业化的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品

芦花鸡粪便：取样自江西省南昌市郊花鸟市场。

1.2 培养基与试剂

MRS培养基：细菌学蛋白胨10 g，牛肉膏5.2 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，柠檬酸三胺2 g，吐温801 mL，磷酸氢二钾0.116 g，硫酸镁0.01 g，一水合硫酸锰0.004 g，无水乙酸钠0.3 g，蒸馏水1 L。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L。

模拟胃液：PBS缓冲液，胃蛋白酶3.0 g·L-1，稀盐酸调节pH为2.0～3.0。

模拟肠液：PBS缓冲液(pH调至8.0)，胰蛋白酶1.0 g·L-1，牛胆盐为0.1%～0.5%。

标准对照菌株：凝结芽孢杆菌ATCC© 7050TM:上海宝录生物科技有限公司。

试剂盒：羟自由基测定试剂盒、DPPH自由基测定试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)：南京建成生物工程研究所；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒：生工生物(上海)股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 凝结芽孢杆菌筛选

将样品稀释液经80 ℃水浴处理15 min，冰浴至常温，稀释涂布于含0.4%溴甲酚紫的MRS培养基，40 ℃孵育48 h，根据菌落形态及变色圈挑取单菌落进行分离纯化。观察菌落的大小、边缘形状、颜色、平滑度等特点，并进行革兰氏染色镜检观察。

1.3.2 菌株鉴定

1.3.2.1 生理生化鉴定

参考《伯杰细菌鉴定手册》对菌株进行生理生化实验见表1。

表1 生理生化实验Table.1 Physiological and biochemical experiment

1.3.2.2 分子生物学鉴定

按照细菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书提取DNA。选取上游引物为27 F，下游引物为1492R；并设置PCR反应程序为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min，4 ℃保存，对目的片段16S rDNA进行扩增及对目的片段进行电泳检测，PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序及比对分析。

1.3.3 种子液及待测样品制备

将已鉴定的22株凝结芽孢杆菌及标准对照菌株ATCC7050的单菌落接至MRS培养基中，40 ℃培养24 h，按4%的接种量在MRS培养基中活化两代，通过MRS培养基稀释后使得其菌浓为1×108CFU·mL-1，并将其作为种子液。按4%的接种量将种子液接种于LB培养基中40℃孵育48h，此时菌株处于稳定期，离心沉淀后通过生理盐水等体积重悬，稀释使其最终活菌数为1×108CFU·mL-1，并将其作为待测样品。

1.3.4 凝结芽孢杆菌抗逆性

1.3.4.1 凝结芽孢杆菌耐热性能及模拟胃肠液耐受性

待测样品在70 ℃，80 ℃和90 ℃水浴中处理5，10，15 min，以标准菌株ATCC7050处理组作为对照，探究凝结芽孢杆菌对高温的耐受性。

待测样品在pH2.0，2.5和3.0的模拟胃液下37 ℃处理3 h，以及在胆盐浓度为0.1%，0.3%，0.5%的模拟肠液中37 ℃处理4 h，以标准菌株ATCC7050处理组作为对照，探究凝结芽孢杆菌在模拟胃肠液中的耐受性。

样品处理后进行稀释涂布计算活菌数，存活率计算如下：

Nn：样品处理后的活菌数，CFU·mL-1；No：样品处理前的活菌数，CFU·mL-1

1.3.4.2 主成分分析

将凝结芽孢杆菌抗逆性数据进行主成分分析，通过KOM和巴特利特球形度检验判断主成分分析的可行性。根据总方差解释得到主成分见表2，经IBM SPSS Statistics23处理得到主成分的线性组合，按主成分的得分方差所占比例得到总得分，通过总得分比较凝结芽孢杆菌的综合耐受性。

1.3.5 产乳酸性能

采用高效液相色谱法(HPLC)测定产乳酸性能(1260，Agilent，USA)。按4%的接种量将种子液接种于MRS培养基，40 ℃孵育24 h，菌悬液10 000×g离心10 min取上清，同时梯度稀释乳酸标准品制作标准曲线，将上清液及标准品通过0.22 μm滤膜过滤上机测定，根据乳酸标准曲线计算样品中乳酸含量。

1.3.6 胆固醇降解活性

按4%的接种量将种子液接种于含50 μg·mL-1胆固醇(溶剂为乙醇)的MRS液体培养基中，40 ℃孵育24 h，按照邻苯二甲醛法[12]计算胆固醇去除率，公式如下：

Co：孵育前胆固醇含量，μg；Cn：孵育后胆固醇含量，μg

1.3.7 抗氧化性能

按4%的接种量将种子液接种于MRS培养基，40 ℃孵育24 h得到待测菌液，此时待测菌液处于稳定期。羟自由基清除性能、DPPH自由基清除性能和总抗氧化活性按试剂盒说明书进行操作。

1.3.8 安全性评价

将种子液接种于哥伦比亚血琼脂平板确定菌株溶血性，以金黄色葡萄球菌CMCC26003作为对照。将种子液涂布于MRS平板并放置药敏纸片，在40 ℃下培养24 h后，测量其抑菌直径评价药物敏感性，10种常用药敏纸片种类见表4。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定结果

从鸡粪便中分离鉴定得到22株凝结芽孢杆菌，菌落表面略显粗糙，呈颗粒状，有光泽且不透明，边缘较规则，中心凸起，菌落较大，符合凝结芽孢杆菌的形态特征。所得菌株的革兰氏染色如图1～3所示，生理生化鉴定结果如表1所示，符合凝结芽孢杆菌的生理生化特征。经分子生物学鉴定可知初筛得到的22株菌可确定为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，菌株NCUBCG003、NCUBCG004及NCUBCG014的系统发育树如图4所示，其分子生物学鉴定结果见附件1。

图1 凝结芽孢杆菌NCUBCG004的菌体形态(1000×)Fig.1 Morphology of Bacillus coagulans NCUBCG004(1000×)

图2 凝结芽孢杆菌NCUBCG014的菌体形态(1000×)Fig.2 Morphology of Bacillus coagulans NCUBCG014(1000×)

图3 凝结芽孢杆菌NCUBCG003的菌体形态(1000×)Fig.3 Morphology of Bacillus coagulans NCUBCG003(1000×)

图4 凝结芽孢杆菌NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus coagulans NCUBCG003,NCUBCG004 and NCUBCG014

2.2 凝结芽孢杆菌抗逆性

2.2.1 耐热性能

芽孢杆菌菌剂的工业化生产通常采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥中所产生的70 ℃～90 ℃的高温要求芽孢杆菌有较高的耐高温能力，因此耐高温性能是筛选优良芽孢杆菌的重要指标之一[13]。

如图5所示，22株凝结芽孢杆菌除NCUBCG016外经90 ℃处理后存活率均在60.0%以上，部分菌株存活率随温度升高而降低。菌株ATCC7050、NCUBCG014、NCUBCG001、NCUBCG002、NCUBCG009、NCUBCG017在不同温度处理后存活率稳定，达90.0%；特别是NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG007在90℃处理后存活率高达95.0%以上。有研究表明，凝结芽孢杆菌均具备一定的耐热性，凝结芽孢杆菌ATCC8038在pH为4.0的番茄汁中，经95 ℃高温处理20 min后其活菌数仅降低1 log·CFU·mL-1[14]。在经80 ℃处理10 min后凝结芽孢杆菌的存活率普遍降低，可能是温度和萌发培养基不能完全刺激芽孢萌发；有研究表明经70 ℃～80 ℃处理后凝结芽孢杆菌营养体已死亡，且在此温度下芽孢萌发率较低，同时芽孢萌发需要受体蛋白的作用，不同的营养剂对受体蛋白的促进具有特异性[15]。综合以上分析可知，凝结芽孢杆菌对高温均有一定的耐受性，尤其是菌株NCUBCG014、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG006和NCUBCG007等能够在工业化生产过程中保持较高的存活率。

处理组图5 凝结芽孢杆菌耐热性能Fig.5 Heat resistance of Bacillus coagulans

2.2.2 模拟胃肠液耐受性

如图6所示，经pH=2.0的模拟胃液处理后，大部分菌株存活率较低，菌株的存活率随pH值的升高而升高，经pH=3.0的模拟胃液处理后多数菌株存活率可达95.0%以上，菌株NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG007、NCUBCG014经pH=2.0胃液处理后存活率仍达85.0%以上。有研究表明，通常情况下人体胃酸pH约为2.0～3.0，动物胃液略高，在食物未消化完全的情况下胃部pH可达3.0以上[16]。

图6 凝结芽孢杆菌模拟胃肠液耐受性Fig.6 Tolerance of Bacillus coagulans to simulated gastrointestinal fluid

所有菌株在不同胆盐浓度的模拟肠液处理后存活率均在66.20%以上，随着胆盐浓度升高，多数菌株存活率降低；但菌株NUCBCG004和NUCBCG014经0.5%的胆盐处理后存活率高达99.0%以上，而NCUBCG003和NCUBCG002耐胆盐能力稍差，其存活率仍可达90.0%以上。另一方面，菌株NCUBCG012经高浓度胆盐比低浓度胆盐处理后存活率高，有研究表明高胆盐中钠盐和钾盐可能会促进芽孢的生成[17]；NCUBCG023等菌株经胆盐处理后存活率较低，多项研究表明菌株的耐胆盐能力较弱可能与胆盐水解酶不足有关[18]。

标准菌株ATCC7050相比于其他凝结芽孢杆菌在模拟胃肠液环境下能够稳定地保持较高的活性，存活率约为90%。有报道对凝结芽孢杆菌MTCC5856等标准株的体外模拟胃肠液耐受性进行分析，研究发现这些标准菌株对模拟胃肠液等恶劣环境具备较强的抗逆性，在食品等领域体现出极高的应用价值[19]。综合分析可知本研究所筛选的大多数凝结芽孢杆菌能够在其他食物存在的情况下，在胃部保持较高的活性，同时对胆盐环境也有一定的耐受性，而菌株NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014对胃肠道环境有极高的耐受性，能够在胃肠道环境下维持较高的活性，发挥其益生作用。

2.2.3 主成分分析结果

2.2.3.1 适用性检验与成分提取结果

经计算KMO取样适切性量数为0.681(>0.6)，巴特利特球形度检验的显著性为0.000(<0.05)，两种检验结果都说明了凝结芽孢杆菌抗逆性指标间存在相关性，适用于主成分分析法[20-21]。

如表2所示，共提取3种主成分并命名为Z1、Z2、Z3，可解释总方差的78.03%，即可以通过3种主成分的综合得分在权重为78.03%的基础上评价菌种抗逆性(耐热能力和胃肠道耐受性)。

表2 各成分总方差解释Table.2 Interpretation of total variance of each component

2.2.3.2 主成分计算及得分结果

由表3可知，菌种NCUBCG004、NCUBCG003、NUCBCG014综合得分排名前三，而ATCC7050综合得分在第五位，说明相比于标准菌株以及其他凝结芽孢杆菌，这3株菌在耐热和胃肠道耐受性的综合性能上表现最为优良，对恶劣环境的抗逆性最强。

2.2.3 产乳酸性能

经测定乳酸标准曲线为y=0.2862x-13.398,R2为0.9999，可用于乳酸含量测定。

表3 凝结芽孢杆菌各主成分得分及综合得分Table.3 Main component scores and comprehensive scores of Bacillus coagulans

由图7可知，菌株NCUBCG007、NCUBCG008的乳酸产量不足1.0 g·L-1，可能是由于本研究所用MRS培养基影响了糖酵解、糖异生和三羧酸循环等途径，与产乳酸相关的酶促反应速度下降，使得乳酸含量较低[22]；其次菌株之间的差异也是造成其乳酸产量不同的原因之一。而菌株NCUBCG012、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG014的乳酸产量相比于其他凝结芽孢杆菌较高，可达5.0 g·L-1以上，标准菌株ATCC7050产乳酸能力最高，达8.83 g·L-1，有利于在宿主体内发挥抑菌、调节肠道菌群结构等作用。

菌种注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)图7 凝结芽孢杆菌产乳酸能力Fig.7 Lactic acid content of Bacillus coagulans

2.2.4 胆固醇降解能力

如图8所示，凝结芽孢杆菌胆固醇去除率均在25.0%以上，NCUBCG008、NCUBCG006、NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014五株凝结芽孢杆菌的胆固醇去除率可达50.0%以上；而标准对照菌株ATCC7050的胆固醇去除率仅为35.71%，同时菌株NCUBCG012、NCUBCG017和NCUBCG023的胆固醇去除率也相对较低，只有25.0%左右。有体外研究表明，益生菌有一定的降解胆固醇的能力，受菌株差异、生长阶段等因素的影响，胆固醇去除率不尽相同，凝结芽孢杆菌MTCC5856的胆固醇去除率最高可达48.42%[23]。由此可见，凝结芽孢杆菌NCUBCG008、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG014和NCUBCG006的胆固醇降解能力相对较高。

菌种注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)图8 凝结芽孢杆菌胆固醇去除率Fig.8 Cholesterol degradation rate of Bacillus coagulans

2.2.5 抗氧化活性

2.2.5.1 羟自由基清除能力测定结果

定义：规定每毫升的菌液在37 ℃下反应1min，使反应体系中H2O2浓度降低1 mmol·L-1为一个抑制羟自由基能力单位。

据图9可知，凝结芽孢杆菌的羟自由基清除能力均在50.0 U·mL-1以上，菌株差异不大，以标准株ATCC7050的羟基自由基清除能力最弱，达52.44 U·mL-1，而菌株NCUBCG002、NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014高达60.0 U·mL-1以上，羟自由基清除能力最强。

菌种注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)图9 凝结芽孢杆菌羟自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacity of Bacillus coagulans

2.2.5.2 DPPH自由基清除能力测定结果

DPPH自由基的清除能力主要靠菌液中抗氧化剂的供氢能力决定的，不同的菌株对多肽等抗氧化剂的代谢能力上也有所不同。据图10可得,凝结芽孢杆菌的DPPH自由基清除率在60%以上，其中NCUBCG007和NCUBCG0018则较低，特别是标准菌株ATCC7050地DPPH自由基的清除率最低，只有62.64%；有研究表明，凝结芽孢杆菌具备潜在的抗氧化性能，菌株T242的DPPH自由基清除率仅有35.0%[24]。而菌株NUCBCG003、NCUBCG004、NCUBCG006和NCUBCG014的DPPH自由基清除率最高，可达75%以上。

菌种注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)图10 DPPH自由基清除能力Fig.10 DPPH free radical scavenging capacity of Bacillus coagulans

2.2.5.3 总抗氧化性能测定结果

据图11中所示，本文所研究的凝结芽孢杆菌总抗氧化性能均可相当于1 mmol·L-1以上的FeSO4溶液，菌株NCUBCG002、NCUBCG08、NCUBCG016和NCUBCG025总抗氧化性能较弱，标准菌株ATCC7050的总抗氧化能力也仅相当于2.24 mmol·L-1的FeSO4溶液；而不同的是，菌株NCUBCG001、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG014和NCUBCG017的总抗氧化能力相对较强，尤其是NCUBCG014的总抗氧化能力相当于3.5 mmol·L-1的FeSO4溶液。

菌种注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)图11 总抗氧化能力(FRAP)Fig.11 Total antioxidant capacity of Bacillus coagulans (FRAP)

2.6 安全性评价

如表4所示，标准株ATCC7050、NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014均为γ溶血，而阳性对照株金黄色葡萄球菌CMCC26003表现出β溶血性(出现透明溶血环)，表明这3株凝结芽孢杆菌均无溶血活性；且抗生素敏感性测定结果可表明凝结芽孢杆菌NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014对常见的10种抗生素均敏感，因此可以说明这3株凝结芽孢杆菌为安全菌种[25]。

表4 凝结芽孢杆菌抗生素敏感性与溶血活性Table.4 Antibiotic sensitivity and hemolytic activity of Bacillus coagulans

3 结论

本文研究通过热胁迫处理从芦花鸡粪便分离鉴定出22株凝结芽孢杆菌，分析了凝结芽孢杆菌耐热性能及胃肠道耐受性，并通过主成分分析法综合比较凝结芽孢杆菌抗逆性，同时评价22株凝结芽孢杆菌的产乳酸能力、胆固醇降解能力以及抗氧化活性。实验结果表明菌株NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014在抗逆性及乳酸菌常见益生性能上均优于其他凝结芽孢杆菌，且体外安全性评价表明NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014为安全菌种。综合以上分析可知，凝结芽孢杆菌NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014在所评价的各项基础益生性能上表现为潜在优良的菌株，具备在人和动物体内发挥益生作用的潜能，能够丰富微生物优良菌种资源，为凝结芽孢杆菌产业化应用和发展提供动力，同时本文评价方法可为益生菌性能评价提供参考。