柚皮苷通过cAMP/PKA/CREB通路促进人脂肪间充质干细胞成骨分化

张亮亮，赵程锦，周煜虎，曹 博，段明明，冯阳阳

(延安大学附属医院创伤骨科，陕西 延安 716000)

脂肪间充质干细胞是一类来源于脂肪组织的成体干细胞，具有自我更新和分化为脂肪细胞、软骨细胞及成骨细胞等多类细胞的多向分化潜能，随着脂肪间充质干细胞分离及鉴定技术日趋成熟，可将其用于骨组织工程进行骨损伤修复以及治疗骨相关疾病[1]。然而如何保证脂肪间充质干细胞的成骨方向单向分化，进而提高修复及治疗效率是当前骨组织工程领域亟待解决的问题。柚皮苷是一类双氢黄酮类化合物，是中药骨碎补的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗微生物、抗诱变、抗癌等作用，已有研究表明柚皮苷可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[2]。然而有关柚皮苷能否调控脂肪间充质干细胞成骨向分化的报道极少。环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)通路是G蛋白偶联受体下游重要的信号通路，在干细胞成骨分化过程发挥重要的诱导作用，已有报道指出通过调节cAMP/PKA/CREB信号通路可调控脂肪间充质干细胞的成骨分化[3]。但柚皮苷能否通过调节cAMP/PKA/CREB信号通路调控脂肪间充质干细胞的成骨向分化尚未可知。故本研究选取人脂肪间充质干细胞进行体外细胞实验，探究柚皮苷通过调节cAMP/PKA/CREB信号通路调控人脂肪间充质干细胞成骨分化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1实验细胞与试剂:人脂肪间充质干细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司，生产批号CP-H202)；柚皮苷(购自上海纯优生物科技有限公司，生产批号P0027)；cAMP抑制剂(SQ22536)(购自上海蓝木化工有限公司，生产批号S8283)；地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(购自上海联硕生物科技有限公司，生产批号D1756、G6251、N/A-1255)；四唑硝基蓝(BCIP/NBT)碱性磷酸酶(ALP)显色试剂盒、ALP检测试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，生产批号C3206、P0321M、P0012)；茜素红S(ARS)染色试剂盒(购自上海拜力生物科技有限公司，生产批号8678)；人cAMP酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购自江西艾博因生物科技有限公司，生产批号IB-E10006)；总核糖核酸(RNA)提取试剂盒(购自上海科敏生物科技有限公司，生产批号80224)；PKA、CREB、矮小相关转录因子2(Runx2)、骨钙素蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、磷酸脱氢酶(GAPDH)聚合酶链反应(PCR)引物(委托上海沪宇生物科技有限公司合成)；总蛋白提取试剂盒(购自上海雅吉生物科技有限公司，生产批号D1700)；细胞核蛋白提取试剂盒(购自上海梵态生物科技有限公司，生产批号FT30504yy)；兔抗人PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、Runx2、OCN、OPN、GAPDH、组蛋白3(H3)单克隆抗体(一抗)，羊抗兔PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、Runx2、OCN、OPN、GAPDH、H3辣根过氧化物酶标记多克隆抗体(二抗)(购自广州威佳科技有限公司，生产批号P4234Rb-h、9621、PA1-850、MA5-11192、12556、ab93876、ab8448、5174S、ab1791；A10547、65-6120、A24537、32260、G-21234、31466、A24531、31461、ab6721)。

1.1.2实验设备:IX73型倒置显微镜(购自日本奥林巴斯)；3-18K型高速冷冻离心机(购自德国Sigma)；SpectraMax iD5型多功能酶标仪[购自美谷分子仪器(上海)有限公司]；7500型PCR仪(购自美国ABI)；EPS-200型电泳仪(购自上海天能科技有限公司)。

1.2方 法

1.2.1细胞培养、分组与给药:将人脂肪间充质干细胞接种至杜氏改良培养液(DMEM)(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中常规培养，当细胞融合度达70%时，按1∶3重悬细胞进行传代。当细胞传至第3代时，调整细胞密度为1×105个/mL，将细胞分为对照组、柚皮苷低、中、高剂量组、cAMP抑制剂(SQ22536)组、成骨分化诱导组(诱导组)，柚皮苷低、中、高剂量组分别加12.5μmoL/L、25μmoL/L、50μmoL/L柚皮苷，SQ22536组加100μmoL/L SQ22536，诱导组加10-8moL/L地塞米松、10mmoL/L β-甘油磷酸钠和50mg/L抗坏血酸诱导脂肪间充质干细胞成骨分化；对照组仅加等体积DMEM培养液，每组设置6个复孔。

1.2.2ALP染色及磷酸对硝基苯酯(PNPP)法检测各组细胞ALP活性:培养48h后，取各组细胞接种于6孔板，调整细胞密度为5×104个/mL，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3遍，多聚甲醛固定，加入BCIP/NBT工作液覆盖样品，室温避光25min，去除工作液，蒸馏水洗2次终止反应， 倒置显微镜下观察 ALP 染色情况；另取各组细胞加细胞裂解液，12000 r/min(有效离心半径 6.3cm)4℃离心10min后取上清，BCA法检测上清蛋白浓度，根据试剂盒要求添加检测缓冲液、显色底物、标准工作液及检测样品，室温孵育5min后终止反应，酶标仪于405nm处检测各组细胞ALP活性。

1.2.3ARS染色观察各组细胞钙沉积:培养48h后，取各组细胞接种至24孔板，调整细胞密度为1×105个/mL，多聚甲醛固定，PBS洗涤，500μL茜素红s染液染色30min，倒置显微镜下观察各组细胞钙沉积情况。

1.2.4ELISA法检测各组细胞cAMP水平:培养48h后，取各组细胞，加细胞裂解液 12000r/min (有效离心半径6.3cm)4℃离心10min后取上清，严格按照cAMP试剂盒操作说明检测各组细胞cAMP水平。

1.2.5实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN信使核糖核酸(mRNA)表达:培养48h后，取各组细胞，根据总RNA提取试剂盒操作说明提取细胞总RNA，反转录为互补脱氧核糖核酸，进行PCR反应，引物序列见表1，PCR反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，65℃ 30s，45个循环。本研究选取GAPDH为内参基因，并通过2-ΔΔCt[4]方法表示各组细胞目的基因相对表达量。

1.2.6蛋白质免疫印迹法(WB)检测各组细胞PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN蛋白表达及p-PKA、p-CREB水平：培养48h后，取各组细胞，根据总蛋白提取试剂盒提取细胞PKA、RUNX2、OCN、OPN总蛋白，同时根据核蛋白提取试剂盒操作说明提取细胞p-PKA、p-CREB、CREB核蛋白；BCA法检测蛋白浓度，上样20μg，电泳，转膜，封闭，加一抗(稀释比例1∶1000)4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记二抗(稀释比例1∶2000)室温孵育1h，进行显影分析。其中p-PKA、p-CREB、CREB选取H3为内参基因，其余基因选取GAPDH为内参基因。

表1 PCR反应引物序列

2 结 果

2.1各组细胞ALP染色结果和ALP活性比较:对照组可见少量蓝色沉淀，SQ22536组蓝色沉淀最少，诱导组和柚皮苷低剂量组蓝色沉淀增多，柚皮苷中剂量组蓝色沉淀进一步增多，柚皮苷高剂量组蓝色沉淀最多。与对照组比，SQ22536组ALP活性显著下降(P<0.01)；与对照组和SQ22536组比，诱导组和柚皮苷3剂量组ALP活性显著上升(P<0.01)；诱导组和柚皮苷低剂量组ALP活性差异无统计学意义(P>0.05)；柚皮苷3剂量组ALP活性呈剂量依赖性。见图1和表2。

图1 各组细胞ALP染色结果

表2 各组ALP活性

2.2ARS染色观察各组细胞钙沉积情况:对照组存在少量钙沉积，SQ22536组细胞钙沉积显著减少，诱导组和柚皮苷低剂量组钙沉积增加，柚皮苷中剂量组钙沉积进一步增加，柚皮苷高剂量组钙沉积最多。见图2。

图2 各组细胞ARS染色结果

2.3各组细胞cAMP水平、PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN mRNA表达:与对照组比，SQ22536组细胞cAMP水平、PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN mRNA表达显著下降(P<0.01)；与对照组和SQ22536组比，诱导组和柚皮苷3剂量组上述指标上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；诱导组和柚皮苷低剂量组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)；上述指标柚皮苷3剂量组呈剂量依赖性。见表3、4。

表3 各组细胞cAMP水平

表4 各组细胞PKA CREB RUNX2 OCN OPN mRNA表达

2.4各组细胞PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN蛋白表达及p-PKA、p-CREB水平:与对照组比，SQ22536组细胞PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN蛋白表达及p-PKA、p-CREB水平显著下降(P<0.01)；与对照组和SQ22536组比，诱导组和柚皮苷3剂量组上述指标上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；诱导组和柚皮苷低剂量组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)；上述指标柚皮苷3剂量组呈剂量依赖性。见图3、4和表5、6。

图3 各组细胞PKA、CREB蛋白表达及p-PKA、p-CREB水平

表5 各组细胞PKA CREB蛋白表达及p-PKA p-CREB水平

表6 各组细胞RUNX2 OCN OPN蛋白表达

图4 各组细胞RUNX2、OCN、OPN蛋白表达

3 讨 论

脂肪间充质干细胞是骨组织工程学中最具有研究潜力的间充质干细胞之一，因其具有来源广泛、取材方便、损伤小、免疫原性低、增殖迅速、表型稳定等优点，已然成为骨组织修复领域重要的种子细胞之一[5]。而如何提高脂肪间充质干细胞的成骨向分化能力及成骨活性是当前再生医学及骨组织工程的研究热点。

SQ22536是针对cAMP的抑制剂，可有效抑制cAMP/PKA/CREB信号通路[6]，成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸联合使用可诱导细胞成骨分化[7]，故本研究选取SQ22536和成骨诱导剂分别作为研究的阴性和阳性对照，确保本研究的严谨性和准确性。本研究结果表明柚皮苷可促进脂肪间充质干细胞ALP表达和钙沉积，上调ALP活性，发挥促进脂肪间充质干细胞成骨分化的作用。在骨代谢过程中成骨细胞占据重要地位，柚皮苷作为骨碎补的主要活性单体成分，可调节骨代谢[8]，据此推测柚皮苷可能通过调节骨代谢从而促进脂肪间充质干细胞的成骨分化。

本研究结果表明柚皮苷可上调cAMP水平，促进PKA、CREB表达，上调p-PKA、p-CREB水平，促进RUNX2、OCN、OPN表达，促进脂肪间充质干细胞的成骨分化。当信号分子与细胞膜上G蛋白偶联受体结合时可上调第二信使cAMP水平，cAMP激活PKA，活化的PKA入核进一步磷酸化激活CREB，与特异性反应原件结合，启动基因的转录作用，cAMP/PKA/CREB通路在细胞的成骨分化过程发挥重要作用[9]。ALP和Runx2是细胞成骨分化的早期标志物，OCN和OPN是细胞成骨分化的晚期标志物，在脂肪间充质干细胞成骨分化过程中发挥重要作用[10]。崇显瑾等[11]指出通过激活cAMP/PKA/CREB通路，上调cAMP、p-PKA/PKA和p-CREB/CREB水平，可提高成骨细胞活力；韩宇等[12]指出通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路，可促进ALP表达，发挥促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的作用；Xie W等[13]指出通过抑制cAMP/PKA/CREB信号通路，下调cAMP、p-PKAs和p-CREB水平，抑制RUNX2、OCN表达，可抑制骨髓间充质干细胞的成骨向分化；Yu W等[14]指出激活cAMP/PKA/CREB信号通路，上调ALP活性，促进RUNX2表达，可促进骨髓间充质干细胞成骨；阎然等[15]指出在诱导脂肪间充质干细胞成骨分化过程中，成骨分化关键转录因子RUNX2、OCN、OPN及ALP的表达上升。本研究结果与上述研究结果一致，提示柚皮苷可能通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路，上调cAMP水平，促进PKA、CREB表达，上调p-PKA、p-CREB水平，促进RUNX2、OCN、OPN表达，发挥促进人脂肪间充质干细胞成骨分化的作用。

综上所述，柚皮苷可促进人脂肪间充质干细胞成骨分化，可能通过激活cAMP/PKA/CREB通路，促进RUNX2、OCN、OPN表达，上调ALP活性发挥调节功能；柚皮苷呈剂量依赖性。