贵州4株花脸香蘑的分离鉴定及秋栽驯化*

张秀伟，鲍 菊，张万萍，蔡甫格，牛力立

（1．安顺市农业科学院，贵州 安顺 561000；2．贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025）

花脸香蘑[Lepista sordida（Fr．）Singer]隶属伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomatacete）香蘑属（Lepista），其香味浓郁、口感清脆、色泽怡人，蛋白质含量丰富，氨基酸种类齐全，还富含多种微量元素和维生素，营养价值和经济价值极高，是一种开发价值很高的食用菌[1-2]。从上世纪90年代开始，就有关于花脸香蘑人工驯化栽培及小规模试验的相关报道，但因存在着产量不高，品质不佳和稳定性差等问题，至今未实现大规模栽培[3]。贵州黔中地区气候温暖湿润，冬暖夏凉，菌物资源丰富；花脸香蘑在该地区各处都有零星分布，当地人称之为“米汤菌”或“毛草菌”，野外出菇时间一般为4月～6月或9月～10月。通过对黔中地区不同来源地的花脸香蘑资源进行分离鉴定，并根据当地气候特点进行秋栽冬收试验，拟筛选出优良菌株及配套栽培模式，以促进花脸香蘑的开发利用。

目前，花脸香蘑栽培相关研究中，一般选用稻草、麦秆、竹糠、木屑、棉籽壳等为原料进行栽培[4]。贵州省是茶树种植大省，每年茶树枝叶修剪量约为300 kg·667-1m-2～500 kg·667-1m-2[5]，试验以修剪下的茶树枝叶为主要栽培料，研究花脸香蘑培养料的新配方。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株NK、LM、GS、JUF分别采自贵州省的普定县、镇宁县、长顺县广顺镇及安顺市。组织分离纯化后的4个菌株均保存于安顺市农科院分子生物实验室内。

1.2 菌种分离

以新鲜、无虫害的野生子实体为试验样品，采用组织分离法获得菌种。先使用75%酒精棉球对子实体表面进行消毒，后将子实体从菌盖中间掰开，从菌盖、菌柄交接处取一小块菌肉接入PDA平板上，接种完成后将培养皿放入25℃恒温培养箱中进行培养，期间记录菌落形态、颜色、菌丝密度及菌丝长满培养皿的时间。

1.3 品种鉴定

1．3．1 形态鉴定

以子实体的颜色、形状、菌盖直径、菌柄长度和直径、菌褶等形态特征为依据，对照相关分类学工具书，对野生子实体进行初步形态鉴定[6]。

1．3．2 分子生物学鉴定

利用磁珠法、基因组DNA提取试剂盒提取4个菌株菌丝体的 DNA，以ITS5（5′-GGAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）为引物进行扩增。PCR反应体系（30 μL）为：2× Taq PCR Master mix（GeneTech）15 μL，引物 ITS5和ITS4各1 μL，DNA 1 μL，超纯水补足至30 μL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸5 min。扩增产物由武汉天一华煜基因科技有限公司进行测序，序列在GenBank上进行BLAST比对。

1．3．3 系统发育树构建

应用 MEGA 7．0 软件以香菇（Lentinula edodes）为外群，对4个样品序列及以GenBank下载的19个香蘑属样品的ITS序列进行系统发育分析，采用最大似然法（maximum likelihood method）构建系统发育树，以Bootstrap法，经1 000次循环检验系统树的可靠性。

1.4 秋栽驯化

1．4．1 栽培时间及场地

栽培时间为2021年9月18日；场地位于安顺市农业科学院食用菌栽培大棚（绿白膜）。

1．4．2 原种培养料配方及制作

原种培养料配方：高粱94%、麦麸5%、石灰1%。

将称取好的高粱用清水冲洗3次，在含有1%的石灰水中浸泡24 h，滤除多余水分后加入麦麸搅拌均匀，装入12 cm×24 cm×0．005 cm的聚丙烯塑料袋中，121℃高压灭菌3 h。将培养好的母种转接在原种袋内，于25℃条件下培养至菌丝满袋后备用。

1．4．3 栽培种培养料配方及制作

栽培种培养料配方：茶树枝叶碎屑80%、玉米面17%、石灰2%、石膏1%。

将修剪下的茶树枝叶经粉碎机粉碎后，按配方称取各种原料。先将茶树枝叶碎屑和玉米面搅拌均匀，石灰、石膏溶于水后再与培养料混匀，使培养料最终含水量达65%～70%。备好的培养料建堆（高度为 1．2 m～1．5 m、宽度为 2．0 m～2．5 m），按照孔距为30 cm、行距为50 cm的标准，在料堆上打通气孔。当料温达70℃并保持1天后及时翻堆，经过3次翻堆后，发酵料蓬松疏软，长满白色放线菌，无臭味，pH 为 7．5。

1．4．4 栽培场地及覆土材料处理

栽培前先对床面进行预湿，用农药“敌菇虫”处理大棚，并在床面撒石灰以消毒。覆土时选用土质肥沃、结构疏松且通气性好的土壤[7]。使用前用0．5%甲醛喷洒土壤，拌匀后堆置，用薄膜密封5 d；去掉薄膜，将土壤摊晾，待药味挥发后再混入1%的石灰。

1．4．5 发酵料栽培

采用三层播种法，按照箱面宽1 m、料高15 cm的标准铺料，每个菌株菌种用量为1．5 kg·25-1kg-1（干料）。播种后覆盖薄膜进行发菌，待菌丝生长至培养料的2/3后进行覆土（厚度为3 cm），覆土结束则进入出菇管理期。记录播种、覆土、菌丝出土及原基形成的时间，观测子实体的形态特征，统计产量并计算生物学效率。

生物学效率为子实体鲜质量与栽培料干质量的百分比值[8]。

2 结果与分析

2.1 4个野生菌株的形态鉴定

不同来源的样品间菌盖颜色存在一定差异，菌株NK呈深紫色，菌株LM呈淡紫色，菌株GS、JUF呈紫色。各菌株子实体形态特征详见图1。

如图1所示，菌株NK、LM、GS、JUF的菌盖直径分别为2.0 cm～5.5 cm、4.0 cm～6.0 cm、2.0 cm～3.5 cm、2.0 cm～5.0 cm，均表现为近圆形，中间具脐，表面光滑，湿润时半透明或水浸状；菌褶较稀，延生，不等长；菌柄与菌盖同色，实心；菌肉具有芳香气味。结合《中国大型真菌彩色图谱》初步将4株真菌鉴定为香蘑属[9]。

2.2 4个野生菌株的培养特性

4个样品经菌种分离后，菌丝在PDA培养基上的生长情况详见图2。

如图2所示，4个菌株平贴在平板培养基上生长，气生菌丝不强，其中菌株NK和GS的菌落颜色较菌株LM和JUF深；菌株GS、NK菌丝长满培养皿的时间分别为14 d、16 d，菌株LM和JUF菌丝长满培养皿的时间相同，均为17 d。菌株GS生长速度最快，菌丝浓密，生长旺盛，爬壁能力较强；菌株NK、LM、JUF菌丝较浓密，但爬壁能力较弱。

2.3 4个野生菌株的分子鉴定

菌株GS、NK、LM、JUF的ITS序列全长分别为 651 bp、647 bp、650 bp、653 bp。在 GenBank进行BLAST比对发现，4个菌株与花脸香蘑Lepista sordida的相似性均高达99%，因此都鉴定为花脸香蘑。将菌株GS、NK、LM、JUF的ITS序列提交到GenBank，获得4个菌株的登录号分别为OK161036、OK161035、OK161034、OK161033。

2.4 系统发育树的构建

以香菇Lentinula edodes为外群，基于ITS序列构建的系统发育树见图3。

如图3的系统发育树所示，菌株GS、NK、LM、JUF与8个Lepista sordida聚为一支，且不同来源的样品之间亲缘关系较近，基因差异性不大，据此将4株真菌鉴定为花脸香蘑Lepista sordida。

2.5 驯化栽培

2．5．1 花脸香蘑在培养料上的生长情况

采用茶树木屑对菌株NK、LM、GS、JUF进行秋季驯化试验，于2021年9月18日进行播种，4个菌株在栽培种培养料上的生长情况详见表1。

表1 4个花脸香蘑菌株在栽培种培养料上的生长情况Tab．1 Growth of four Lepista sordida strains on substrate of spawn

如表1所示，在温度为20℃～25℃的条件下，菌株NK、GS仅需24 h即可萌发，3天后菌丝开始定植。4个菌株均能在菌丝开始定植后22 d完成发菌。表明茶树修剪枝叶内含有适合花脸香蘑生长所需的营养成分，是一种良好的栽培料。但不同菌株从播种至原基形成的时间存在一定的差异，菌株GS播种后30 d开始形成原基，菌株NK、LM分别需要27 d、40 d形成原基，菌株JUF未形成原基。

除了菌株JUF未出菇外，菌株NK、LM、GS均能出菇，各菌株子实体形态特征详见表2和图4。

表2 花脸香蘑菌株NK、LM和GS的子实体形态特征Tab．2 Morphological characteristics of fruit bodies of Lepista sordida strain NK,LM and GS

图4 3个花脸香蘑菌株的出菇情况Fig．4 The fruiting status of three Lepista sordida strains

如表2所示，不同菌株的出菇特性差异较大，菌株NK原基粗壮，呈分散分布，单个子实体较大，单朵质量达4 g～16 g，两潮菇的生物学效率达25．6%；菌株GS原基呈集中分布，密度较大，子实体个体较小，单朵质量为2 g～8 g，两潮菇的生物学效率为24．5%；菌株LM出菇量较少，生物学效率仅为10．3%。

2．5．2 秋栽花脸香蘑的出菇采收情况

各花脸香蘑菌株于9月中旬进行发酵料栽培，10月中下旬进入出菇期。菌株GS的第1潮菇于11月5日全部采收；11月9日再次出现大量原基，11月25日第2潮菇采收结束；采收期为29 d。菌株NK的第1潮菇于11月11日全部采收；11月16日第2潮菇开始生长，至12月3日采收结束；采收期为33 d。菌株LM于11月6日开始采收，至12月3日结束，潮次不明显；采收期为27 d。

花脸香蘑出菇期间日平均最高气温为14.85℃，最低平均温度为10.38℃。过低的温度将影响花脸香蘑的正常出菇，其影响情况详见图5。

图5 菌株GS在低温下的出菇情况Fig.5 The fruiting situation of strain GS at low temperature

如图5所示，12月份拱棚内最高平均气温约为10℃，此时花脸香蘑菇蕾的生长受到明显抑制，呈僵化状态，不能继续生长形成子实体。

3 结论与讨论

野生种质资源是科研工作得以顺利开展的重要基础，对收集的野生资源进行形态和遗传学鉴定是对其进行保护性开发的重要前提和保障[10]。ITS序列分析作为形态学分类的有益补充，已成为国际上广泛使用的分子生物学鉴定方法[11]。将菌株GS、NK、LM、JUF的ITS序列在GenBank中进行 BLAST比对，结果显示4个菌株与花脸香蘑Lepista sordida的相似度高达99%，结合形态学特征，可确定4株菌株均为花脸香蘑。从系统发育树可知，在一定区域内的花脸香蘑亲缘关系较近，但形态特征上存在一定差异，可结合不同资源的特性开展杂交育种，以期获得优良菌株。

结合黔中地区冬暖夏凉的气候优势对花脸香蘑进行秋栽冬收的研究，结果表明GS、NK、LM 3个菌株均能较好地出菇。因受低温影响，子实体生长速度慢，但个体发育健壮，且病虫害发生几率低，能达到较高的产量，是一种值得推广的栽培模式。菌株GS、NK、LM株的采收期分别为29 d、33 d、27 d，当小拱棚温度降至10℃时，花脸香蘑不能正常生长。为延长花脸香蘑采收期，可进一步开展提前播种或秋冬季同时利用白色塑料大棚和遮阴网进行栽培的研究。

贵州省是茶树种植大省，对于衰老的茶树，常采取重修剪和台割的方式让其复壮，因此产生的茶树枝叶量就会成倍增加；当前对茶树枝叶的处理途径主要为焚烧和还田2种方式，利用率极低[5]。近年来，食用菌栽培中木材消耗对当地生态的影响已逐渐凸显[12]，而利用茶树枝叶作为主料栽培花脸香蘑可有效解决木材消耗的问题。研究表明茶树枝叶碎屑在7天内经3次翻堆后即可完成发酵，最高温度达70℃。花脸香蘑菌种在茶树枝叶发酵料上萌发时间短，发菌快，表明茶树枝叶内含有适合花脸香蘑生长所需的营养成分，是一种良好的栽培料，生物学效率达25%以上，研究结果开辟了花脸香蘑培养料的新途径。