外周血外泌体与类风湿关节炎辅助性T细胞-17/调节性T细胞应答失衡的相关性研究

陈秋华，黄小梅，梁 量，路 杰，谢 彤

（广东医科大学附属医院风湿免疫科，广东湛江 524000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床常见的慢性、对称性、进行性多关节破坏的自身免疫性疾病。流行病学研究显示，RA在我国的发病率在0.3%左右，5年内致残率在30%以上[1]。RA早期临床表现以关节肿胀、疼痛及晨僵为主，若未及时治疗，晚期将会出现骨侵蚀或关节软骨破坏等病理特征[2]。类风湿关节炎发病机制复杂，目前尚未完全明确，可能与自身免疫紊乱有关，其中辅助性T细胞17（Th17）和调节性T细胞（Treg）应答失衡是较为明确的发病机制[3]。Th17/Treg在正常状态下处于动态平衡状态，一旦Th17活化或Treg数量减少，均会引发RA，而相关研究发现，外泌体可调节Th17/Treg细胞应答失衡，且外泌体携带的miRNAs还能反映疾病的病理状态。基于此，本研究就外泌体在RA与Th17/Treg细胞应答失衡的相关性进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2020年1月至2022年1月广东医科大学附属医院收治的90例RA患者的临床资料，根据疾病活动度（DAS28）积分[4]将其分为轻度组（2.6分＜DAS28积分≤3.2分）、中度组（3.2分＜DAS28积分≤5.1分）和重度组（DAS28积分＞5.1分），每组30例；另回顾性分析同期广东医科大学附属医院院内30例健康体检者的临床资料，将其作为对照组。轻度组患者中男性18例，女性12例；年龄35～75岁，平均年龄（49.52±5.31）岁；体质量指数（BMI）23.57～25.15 kg/cm2，平均BMI（24.35±2.54）kg/cm2。中度组患者中男性19例，女性11例；年龄37～78岁，平均年龄（51.02±5.37）岁；BMI 23.41～25.02 kg/cm2，平均BMI（24.41±2.47）kg/cm2。重度组患者中男性17例，女性13例；年龄38～71岁，平均年龄（50.89±5.41）岁；BMI 23.37～25.67 kg/cm2，平均BMI（24.61±2.31）kg/cm2。对照组研究对象中男性12例，女性18例；年龄30～80岁，平均年龄（50.43±5.21）岁；BMI 23.54～25.34 kg/cm2，平均BMI（24.27±2.35）kg/cm2。4组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），组间具有可比性。本研究经广东医科大学附属医院医学伦理委员会批准。纳入标准：①符合《2018中国类风湿关节炎诊疗指南》[5]中RA的诊断标准；②关节功能分级为Ⅰ～Ⅳ级；③入组前未接受相关治疗。排除标准：①精神或认知障碍者；②合并骨折的患者；③合并循环系统疾病者。

1.2 检测方法 于患者入院后第2天清晨或研究对象体检当天清晨，采集其空腹肘静脉血6 mL，分为3等份；其中2 mL利用外泌体试剂盒（德国QIAGEN公司）提取，采集血清外泌体；另外2等份分别用于检测Th17细胞、Treg亚群水平。外泌体检测：利用外泌体RNA提取试剂盒（美国Life公司生产）提取血清外泌体总RNA，试剂盒富集miRNAs，将细胞内有核小RNA（U6）作为内参，通过实时荧光定量聚合酶链反应技术对外泌体miR-223、miR-155表达水平进行检测。Th17细胞检测：取静脉血2 mL，以3 000 r/min转速离心10 min、弃血清，将10 μL CD4-FITC单抗加入沉淀细胞中，常温、避光条件下孵育15 min，采用5 mL PBS缓冲液洗涤，并加入100 μL固定液，再次孵育15 min，二次加入PBS洗涤；离心、弃血清，将100 μL破膜剂加入沉淀细胞中，混合，避光孵育5 min，加入10 μL Alexa Fluor647IL-17 抗体，混合，避光孵育15 min，3次加入PBS洗涤；离心、弃血清，采用ZE5流式细胞仪测定Th17细胞含量。Treg亚群检测：在2 mL静脉血中加入50 μL乙二胺四乙酸抗凝处理，随后分别加入10 μL单克隆抗体（CD25-PE、CD4-FITC、CD127-PE-CY5）混匀，室温下孵育20 min，随后加入500 μL红细胞裂解液，、混匀后再加入5 mL 磷酸缓冲盐溶液（PBS）；离心弃血清，并于沉淀细胞中加入300 μL PBS缓冲液重悬细胞，同时采用流式细胞仪（上海艾研生物科技有限公司，型号：ZE5）测定Treg亚群含量。计算Th17/Treg。

1.3 观察指标 ①比较各组研究对象Th17、Th17/Treg和Treg亚群水平。②比较各组研究对象miR-223、miR-155表达水平。③分析外泌体与Th17/Treg水平对RA的诊断效能。敏感度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%。④分析外泌体miR-223、miR-155水平与RA Th17/Treg水平相关性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以（x）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料以[例(%)]表示，组间比较采用χ2检验；诊断效能采用受试者操作特征（ROC）曲线分析；相关性采用Pearson检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组研究对象Th17、Treg亚群和Th17/Treg水平比较 重度组、中度组及轻度组患者Th17、Th17/Treg水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），重度组、中度组及轻度组患者Treg亚群水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 4组研究对象Th17、Treg亚群和Th17/Treg水平比较（%，x）

2.2 4组研究对象外泌体miR-223、miR-155表达水平比较 重度组、中度组及轻度组患者miR-223、miR-155表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 4组研究对象外泌体miR-223、miR-155表达水平比较（x）

2.3 外泌体与Th17/Treg水平对RA的诊断效能分析 Th17细胞、Treg亚群、Th17/Treg、miR-223、miR-155对RA的 敏 感 度 分 别 为87.04%、88.89%、94.59%、87.04%、88.89%，特异度分别为75.00%、75.00%、81.25%、68.75%、81.25%，见表3、图1。

图1 外泌体与Th17 /Treg水平对RA的诊断效能分析

表3 外泌体与Th17/Treg水平对RA的诊断效能分析

2.4 外泌体miR-223、miR-155水平与RA Th17/Treg水平相关性分析 外泌体miR-223、miR-155水平与Th17细胞、Th17/Treg均呈正相关性，与Treg亚群呈负相关性（P＜0.05），见表4。

表4 外泌体miR-223、miR-155水平与RA Th17/Treg水平相关性分析

3 讨论

RA目前仅能通过服用非甾类抗炎药或糖皮质激素等药物稳定病情、改善临床症状，因此只有明确患者的疾病严重程度，才能给予其合适的药物治疗。相关研究表明，炎症反应、免疫细胞活性失衡等均在RA的发生、发展中发挥重要的作用[6]，因此，通过检测RA相关生物指标的方式，在RA早期诊断和治疗中可发挥重要作用。

Treg细胞属于调节性T细胞，而Th细胞则属于辅助性T细胞，Treg细胞不仅能够激活Th17细胞，而且还能对Th细胞的部分功能进行限制，使Th细胞在机体中保持平衡，从而保证机体内免疫功能的正常运转[7]。Th17细胞可对局部炎症反应进行诱导，同时还能上调滑膜成纤维细胞上的破骨细胞分化因子(RANKL)，从而对关节炎骨组织造成破坏。RA的发生与免疫系统和骨骼系统功能失衡有关，因此，RA发病时，体内的Th17数量和功能也会随之出现异常。

本研究结果显示，重度组、中度组及轻度组患者Th17、Th17/Treg水平均高于对照组，Treg亚群水平均低于对照组，与李智伟等[8]研究结果相似，说明研究结果可信度较高。这提示Th17/Treg细胞应答失衡会引发RA，且Th17/Treg细胞应答失衡越严重，RA病情也会随之加重。外泌体主要由多种细胞产生，含有脂类、蛋白质及核酸等物质，外泌体中的miRNA与自身免疫性疾病、呼吸系统疾病的发生、发展均存在一定关联。本研究结果显示，重度组、中度组及轻度组患者miR-223、miR-155表达水平明显高于对照组，与孙广等[9]研究结果基本一致。这说明根据外泌体miR-223、miR-155表达水平上调情况可有效评估RA的疾病严重程度。另外，本研究对Th17/Treg细胞应答失衡与外泌体miR-223、miR-155水平进行相关性分析后发现，外泌体miR-223、miR-155水平与Th17细胞、Th17/Treg均呈正相关，与Treg亚群呈负相关性。这提示外泌体异常表达可反映RA Th17/Treg细胞应答失衡状态，进而有效评估RA患者的疾病严重程度。

综上所述，RA的发生、发展与外泌体miR-223、miR-155和Th17/Treg均存在一定关联，可根据外泌体miR-223、miR-155表达情况明确RA患者体内的Th17上升和Treg亚群下降情况，在判断RA病情严重程度方面具有重要意义。