外泌体分离检测方法的研究进展

王煜彤，侯诗源，吕云华，马瑞雪，刘梓谕，吴兴安，刘蓉蓉

(空军军医大学基础医学院： 1学员二大队， 2微生物与病原生物学教研室，陕西 西安 710032)

外泌体存在于各种体液中，如腹水、血液、脑脊液、泪液、尿液以及唾液等。外泌体携带大量胞内和胞外的生物信息，可作为细胞通讯和细胞外基质重塑的媒介，与人类健康和疾病息息相关[1]。因为外泌体可以携带源细胞和组织中的生理变化信息，所以也可作为诊断生物标志物[2]。随着对外泌体研究的不断深入，外泌体在临床诊断、疾病治疗、组织再生等方面显示出重要的研究价值[3]。外泌体形成始于细胞膜的内吞作用，包括受体介导的内吞作用、包涵体蛋白的核内吞作用和胞吐[4]。内吞后形成早期内体，晚期内体内陷导致腔内囊泡形成，多囊泡体通过细胞骨架和微管网络传输至细胞膜，通过胞吐作用释放成为外泌体。

外泌体作为物质运输的载体，在细胞间通讯中起着至关重要的作用，反映了源细胞的状态和特征。外泌体大小各异，直径为30～200 nm，即使从同一个细胞系分泌出的外泌体，大小也有很大差异。外泌体具有单层膜结构，富含蛋白质、脂质等生物大分子。与其他囊泡不同，外泌体内含多种核酸，包括各种RNA、基因组DNA和线粒体DNA等，尤其富含多种小型非编码RNA 。这些包含在脂质双层结构中的遗传物质可以通过细胞的内吞途径融合于源细胞或在受体细胞之间进行转移。外泌体包含多种跨膜蛋白、脂锚定蛋白和可溶性蛋白等。其中四跨膜蛋白家族(CD81、CD82、CD37和CD63)在外泌体中高度富集，而不会出现在血浆中[5]。四跨膜蛋白家族自身不具有催化活性，但可以促进其他膜蛋白的运输[6]。

外泌体的产生是细胞蛋白质质量控制机制之一，它使细胞能够快速、有选择性地将蛋白质从质膜上清除[7]。外泌体也是细胞外基质的组成成分之一，并且能通过细胞间的运输扮演信号转导和分子转运的角色。多项研究表明，外泌体可作为多种疾病的标志物，其蛋白质和核酸的含量在源细胞中处于稳定状态[8]。外泌体在不同的癌症亚型中均有表达，是一种潜在的肿瘤标志物[9]。此外，1型糖尿病患者的外泌体有望成为新的诊断指标和潜在治疗靶点[10]。外泌体在促进细胞运输系统的运行和调节机制方面的研究中也取得了很大的进展，对恶性肿瘤的免疫也有积极作用[11]。外泌体作为天然性转运载体，具有纳米级粒径及良好生物相容性，可以携带RNA、蛋白质及小分子药物，相比于传统的脂质体、微球等人工合成的药物载体，是一种很有前景的靶向递药载体[12]。由于外泌体的特征性识别、分离和定量检测在研究中非常关键，因此本文对其分离检测方法的相关研究进展作一综述。

1 外泌体的分离纯化

提取技术的可靠性和稳定性是外泌体研究的前提。活体样本的外泌体不仅体积小，数量也极少，这使外泌体的分离和纯化非常困难。根据直径大小、蛋白质、核酸等方面的差异，可以采用不同的分离方法从细胞培养物或体液中提取不同来源的外泌体[13]。

1.1 离心

离心可分为超速离心和密度梯度超速离心。超速离心是目前提取外泌体最常用的方法，也被认为是外泌体分离的“金标准”。根据大小差异，可采用超速离心法分离外泌体。该方法单次提取量高、成本低，但处理时间长、设备昂贵、回收率低、纯度低，可能导致非外泌体成分(如杂质蛋白和病毒)聚集。此外，反复离心可引起外泌体损伤，导致外泌体降解。当需要更高纯度的外泌体时，可以使用密度梯度超速离心法对外泌体进行纯化。此法能有效去除样品中的蛋白质污染，保持其活性和形态。然而，该方法工作量大、步骤复杂、耗时、回收率低。外泌体的分离效果与其粒径和形状无关，而与样品中外泌体的密度有关，密度差越高，分离效果越显著。此外，离心时长也会直接影响纯化效率[13]。

1.2 沉淀法

聚乙二醇沉淀是在一定盐浓度下向样品中加入亲水性聚乙二醇的分离方法。水分子的结合降低了溶质的溶解度，以致在低速离心条件下外泌体出现凝结和沉淀。此法可以实现外泌体的大量分离，且不需要高端昂贵的设备，也不会对生物活性产生任何影响。大多商用试剂盒使用聚合物共沉淀方法富集外泌体，然而，这种方法分离出的外泌体可能含有杂质，如蛋白质聚合物等。

1.3 免疫亲和法

外泌体富含特定的膜蛋白，包括CD9、EPCAM、CD63、RAB5、CD81、ALIX、Annexin等。免疫亲和法通过标记外泌体的特定蛋白质来实现分离。特异性蛋白可以在不同载体底物上与相应抗体特异性结合，从而实现外泌体的分离和富集[14]。基于包被抗体底物的差异，免疫分离的方法可分为磁珠免疫分离、色谱固定相分离、酶联免疫吸附分离等。该方法特异度高、外泌体形态不受影响、操作简单。然而，此方法只能分离具有阳性标记的外泌体，并且提取效率低，外泌体的活性易受pH值和盐浓度的影响[15]。

1.4 基于尺寸的分离方法

超滤和尺寸排阻色谱是基于外泌体粒径来分离外泌体的两种主要方法。超滤的分离效率取决于样品中悬浮物的大小和分子量。目前，一些学者已经通过这种方法成功分离出外泌体。此方法样品预处理工艺简单，但外泌体可能会因压力而变形或断裂，也容易出现堵孔现象，影响分离效率。尺寸排阻色谱是利用分析物的粒度差异进行色谱分离的技术。分离出的外泌体可以有效地从杂质(蛋白质、脂类等)中分离出来，并保持其完整性和生物活性，操作过程简便，外泌体纯度高。然而，它需要相对高质量的色谱柱，否则在外泌体分离过程中容易被蛋白质或脂类污染，故而成本较高[16]。目前，有研究人员采用超滤和尺寸排阻色谱相结合的方法，分离纯化出高质量的囊泡或外泌体[13]。微流体分离是近年来发展起来的一种微尺度快速分离方法，依靠精确的纳米级控制能力，可以实现超快速的外泌体分离，在提高回收率、减少样品体积、缩短处理时间方面显示出良好的应用前景[17]。

文献[18]报道表明，不同的外泌体分离方法会导致其浓度、纯度发生变化。通过超速离心或不同试剂盒分离出的外泌体表现出部分miRNA的差异性[19-20]。也有人提出，分离方法可能会改变外泌体miRNA谱[20]。蛋白组学或流式细胞术分析表明，分离的外泌体经常被共分离的血浆蛋白“污染”，污染程度取决于所使用的分离方法[21]。此外，不同的分离技术也会改变外泌体标志物的检测水平，这可能与不同分离方法分离的外泌体纯度和亚群不同有关。总而言之，外泌体样品的纯度高度依赖于分离方法，并可能导致不同的分离结果。因此，必须谨慎选择合适的外泌体分离纯化方法，减少对后续分析的影响。将多种外泌体分离方法结合使用，能更简单、高效地从微量样本中分离外泌体。

2 外泌体的检测

以往的研究发现，外泌体对肿瘤的发生、转移和靶向治疗有重要影响。外泌体的识别和分析是临床研究的前提和保证。因此，外泌体的定量分析具有重要意义。为了提高分析的效率、灵敏度和可靠性，许多研究者对外泌体的特异性识别提出了新的分析方法，如核酸信息识别、特异性蛋白质识别、脂质识别、表面修饰识别和整体识别等。

2.1 核酸信息依赖性识别

核酸作为外泌体的主要组分之一，携带着来自源细胞的重要遗传信息，主要包括RNA、DNA和miRNA[22]。外泌体核酸可以在体内细胞之间自由传递和交流，这有利于更多基于外泌体RNA的个体化癌症药物发展。外泌体携带的核酸物质可能与疾病有关，尤其在癌症的诊断中有重要意义。此外，它还显示了重要的生理变化信息。核酸物质主要分布在外泌体的内层，被脂质双层包围，这增加了分析过程中核酸识别的难度，所以以这种组分作为外泌体检测靶标的方法很少。

2.2 蛋白质识别

以往的研究发现，外泌体表面有多种特定的蛋白质表达，这些蛋白质将外泌体与其他囊泡区分开，包括四跨膜蛋白家族 (CD9、CD82、CD81和CD63)、热休克蛋白、生物合成蛋白(TSG、Alix)和表面生长因子受体等。其中四跨膜蛋白家族在外泌体表面高度富集，是外泌体鉴定和定量分析的理想标记。

利用蛋白质的免疫识别来检测外泌体是鉴定中最常见的方法之一。通过将蛋白质免疫识别技术与电化学分析、色谱分析、表面增强拉曼散射和微流控检测平台相结合，研究人员建立了多种外泌体分析方法[23-25]。近年来，蛋白质免疫识别技术已被应用于各种外泌体分析方法[26]。YU等[27]发明了一种场效应晶体管生物传感器，使用抗体修饰的还原氧化石墨烯对外泌体进行定量分析，该传感器专门识别外泌体上的CD63蛋白。WANG等[28]报道了一种由金纳米粒子放大的表面声波传感器，用于外泌体高灵敏检测。此外，一些研究人员还通过检测外泌体表面的CD63蛋白与相应抗体的特异性识别，实现外泌体的定量分析[29]。外泌体表面富集大量的特异性蛋白。一方面，单个蛋白质可以对外泌体进行识别和捕获；另一方面，多个特定的蛋白质可以用于多重识别和测定。 FAN等[30]通过抗体的不同识别位点和生物亲和力发明了一种表面等离子体共振成像生物传感器，对非小细胞肺癌衍生的多种外泌体进行了高灵敏度的鉴定，从而有效地区分外泌体与正常肺细胞和非小细胞肺癌细胞。

适配体是通过配体指数富集的系统进化过程选择的寡核苷酸，具有核酸链灵活性、空间构象多样性等基本特征。蛋白质以叠加、互补形状，静电和氢键的形式与适配体实现高亲和力和特异性的结合[31]。与抗体相比，核酸适配体的化学修饰更加容易，且成本低、长期稳定性好、易于合成。依靠外泌体表面蛋白的适配体，通过表面蛋白的识别结合电化学检测可以实现外泌体的定量分析。CD63是外泌体表面最常见的特异性蛋白。许多学者已经实现了CD63适配体对外泌体的检测，并且具有良好的检测效果。此外，一些分析方法使用其他蛋白质适配体来检测外泌体。利用表面特异性蛋白适配体识别联合荧光分析检测外泌体，也是外泌体分析的一个重要方法。ZHANG等[32]开发了一种基于适配体的荧光极化方法，可以直接定量人血浆中的外泌体。其中，适配体与外泌体膜蛋白之间的内在亲和力在外泌体捕获中起着关键作用。此外，一些学者将表面蛋白和适配体识别与其他分析方法相结合，建立了多种外泌体的检测方法，包括比色分析、表面等离子体共振、巨磁电阻生物传感器、点击化学和发光共振能量转移[33-37]。已有研究团队构建了一种适配体电化学传感器，可以在辅助检测DNA纳米结构和纳米四面体的基础上检测肝细胞中的外泌体[38]。还有研究人员将蛋白质的抗体免疫与适配体识别结合起来，实现外泌体的定量分析[39]。

2.3 脂质识别

外泌体的最外层为脂质双层结构，保证内含物的稳定性。脂质识别常与其他识别方法相结合用于外泌体的检测和分析，该方法大大减少了干扰信号，确保外泌体检测的高特异度和高灵敏度，但该方法的操作较为复杂，成本较高。通过与DNA寡核苷酸结合锚定外泌体的脂质双层，TIAN等[40]结合集成核酸扩增芯片数字检测技术，构建了一个用于检测外泌体的高灵敏度微芯片平台。该平台通过锚定胆固醇的纳米探针以识别尿液样本中的外泌体。另外，脂质识别可以与外泌体表面特异性蛋白识别结合，采用双标记识别实现共同识别和检测。基于CD63适配体磁珠标记捕获和胆固醇修饰的DNA探针用于外泌体脂质体鉴定，ZHANG等[41]利用碱性磷酸酶杂交链式反应信号的放大，实现了外泌体的目视检测及紫外可见分光光度计的定量分析。

2.4 表面修饰识别

外泌体直接分析和检测困难巨大，研究者们试图通过核酸、放射性物质和纳米探针对外泌体进行表面修饰，间接检测到外泌体，然后通过测定修饰物来计算外泌体的含量。通过DNA杂交链式反应在特定外泌体上修饰适配体[42]，MORISHITA等[43]使用基于链霉素 - 亲和素生物素系统的碘-125标记特定来源的外泌体，通过对含量的检测和分析，对外泌体进行评价。此外，利用纳米探针对外泌体表面进行修饰，在其识别和检测方面也显示出良好的应用效果。

2.5 整体识别

外泌体的整体识别和分析主要包括影像学分析和分子印迹。因为表面等离子体波深度和外泌体大小处于同一水平线上，PICCIOLINI等[44]提出了一种可以直接检测多个外泌体组的方法。该方法利用表面等离子体共振成像技术对血液中的外泌体进行定量分析。MORI等[45]利用分子表面印迹技术结合抗体修饰纳米粒子，建立了一种定量检测前列腺癌外泌体的荧光方法。该方法无需预处理，且灵敏度高，通过记录质谱产生的外泌体特征，实现了黑色素瘤疾病外泌体含量的分析。DONG等[46]巧妙地设计了一个类似蜂巢的平台，利用表面增强拉曼散射技术实现了外泌体的整体识别。该方法成功地应用于肿瘤患者血浆外泌体的分离和检测。

3 结语

随着外泌体研究的不断深入，对外泌体的结构特征、基本成分、生物发生、形态特征和细胞间功能等方面的研究已经越来越深入。通过对外泌体的分析，越来越多的肿瘤相关生物标志物被发现，如HER2、EpCAM、MUC1、CA125、PTK7和PSA。基于新发现的外泌体标记蛋白，实现了对不同来源细胞外泌体的识别和检测，丰富了外泌体的高效分离和分析方法，为外泌体在癌症诊断和治疗中的应用奠定了坚实的基础。

然而，外泌体的生物发生、分泌、靶细胞摄取和功能尚未完全揭示。外泌体能否在适当的环境中生长、分裂，或参与信号转导机制和是否具有自主生化反应等，尚待确定。现有的外泌体分离技术还有待进一步完善，目前的主要挑战是在实现高含量、低损伤、高回收率的同时实现高通量的外泌体分离。外泌体分析技术面临的挑战是外泌体表面靶标的选择和外泌体来源的识别。今后，不仅需要对不同细胞来源的外泌体的组分(蛋白质、脂类、核酸等)进行测定，而且需要对其特征或来源类型进行分析，从而建立一个简便、高效、可靠的外泌体分离分析标准化程序。