基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 和网络药理学探讨百合疏肝安神汤治疗焦虑性抑郁症的作用机制

邱心悦，石润玉，袁志鹰*， 赵洪庆*

（1.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

焦虑性抑郁症是一种以抑郁症状为主，且伴随着显著焦虑情绪的精神障碍类疾病。临床研究显示，85%的抑郁症患者有不同程度的焦虑情绪，焦虑情绪是导致抑郁症治疗阻抗最主要的因素之一[1]。 因而，焦虑性抑郁症患者具有更重的社会功能损害和更高的自杀率[2]。 焦虑性抑郁症属于中医情志病范畴，古代虽无其病名，但与东汉张仲景所著《金匮要略》中“百合病”症状极为类似，患者表现出“意欲食复不能食，欲卧不能卧，欲行不能行”“常默默”“如寒无寒，如热无热”等[3]。 现代医学的抑郁、焦虑行为，结合临床表现及中医证候特点，认为其基本病机可用基于脑府和肝脏的“瘀、郁”概括[4]。 百合疏肝安神汤是课题组基于仲景论治百合病的学术思想，紧扣抑郁症“瘀、郁”的中医病因病机特点，以疏肝理气、活血安神为治法，结合多年临床实践研制而成，主治伴焦虑、失眠型抑郁症，前期研究表明其具有良好的抗焦虑抑郁疗效[5-6]，但由于中药复方存在多成分、多靶点的特点，使得相互作用机制并不明确。

网络药理学是基于生物学、药理学、生物信息学、计算机科学等多学科融合而成的一门学科。与传统的单成分、单靶点思维不同，其多成分、多靶点、多通路的网络构建思维更适用于中药复方的复杂特性，能够减少中药复方研究的盲目性，更便于发现治疗疾病的潜在靶标与分子机制[7]。 但是，单纯运用现有化学成分数据库对中药材进行成分筛选，并进行网络药理学研究极有可能导致过滤掉药物的某些有效成分，且工作量大，潜在靶点多，不利于后续验证实验的开展。 本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术对中药复方进行成分分析，明确药物的药效物质基础，再结合网络药理学技术探明百合疏肝安神汤治疗焦虑性抑郁症的活性成分及潜在靶点，阐明该方的作用环节、途径与靶点，将有助于该方药的进一步开发应用。

1 材料与方法

1.1 百合疏肝安神汤化学成分分析

1.1.1 色谱条件和质谱条件 色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)，流动相由有机相乙腈（A）和水相（B）组成，其中水相B 中含0.05 mmol·L-1甲酸铵(质谱级)，设置梯度洗脱程序：0～5 min，5%～15% A；5～10 min，15%～35% A；10～20 min，35%～65% A；20～30 min，65%～95% A；流速：0.4 mL/min，进样量：1 μL。

质谱检测条件：采用正负离子分析模式，离子化方式为电喷雾离子化(ESI)。一级质谱扫描检测范围：m/z 100～1700，采用氮气为除溶剂干燥气体，温度为325 ℃，流速为6.8 L/min；鞘气温度为350 ℃；毛细管电压为4.0 kv，Fragment 电压为150 V；二级质谱扫描范围：m/z 50～1000。

1.1.2 百合疏肝安神汤样品溶液的制备 百合疏肝安神汤由百合、柴胡、贯叶金丝桃、姜黄、酸枣仁、人参、紫苏7 味药物组成，药材饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院，经湖南中医药大学药学院袁志鹰副教授鉴定为正品。全方煎煮2 次，每次均加入6倍体积水，合并水煎液，浓缩至生药量为1 g/mL 备用。 取1 mL 浓缩液，加20 mL 甲醇，超声20 min，10 000 r/min 离心5 min，离心半径13.5 cm，取上清液，经0.22 μm 有机微孔滤膜滤过，即得百合疏肝安神汤的样品溶液。

1.1.3 百合疏肝安神汤的化学成分鉴定 采用全扫描-动态排除和数据依赖性扫描，基于Agilent 1290 UPLC-6540 accurate mass Q-TOF 色谱-质谱(UPLC-Q-TOF-MS)联用技术对百合疏肝安神汤中的化学成分进行检测和数据采集。 采用Mass Hunter B.07.00 软件对正负离子模式的一、二级质谱提供的离子峰信息进行分析，根据文献推测总结不同类别化合物的质谱裂解规律，对于已知化合物，通过提取离子流图和比对相关对照品保留时间等达到准确快速鉴定，对于未知化合物，通过精确分子量预测化合物分子式，结合相关质谱裂解规律、文献数据、多级质谱碎片信息达到快速鉴定。

1.2 百合疏肝安神汤网络药理学研究

1.2.1 作用靶点预测 通过中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）将“1.1.3”中检测出的化学成分进行信息检索，得到百合疏肝安神汤活性成分的靶标蛋白。 借助STRING（https://string-db.org/）中Multiple proteins 搜索功能以及UniProt（http://www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，输入蛋白质名称，限制物种为“Homo sapiens”， 查询与目标蛋白质相对应的基因名称，并校准所得蛋白质，同时剔除非目标活性成分，获得活性成分与相关靶点的信息。

1.2.2 疾病靶点的获取与收集 在GeneCards（https://www.genecards.org/）中以关键词“anxious depression”进行查询，整合结果至Excel，与百合疏肝安神汤候选靶标蛋白共同上传至VENNY 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）进行匹配映射。

1.2.3 蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）的构建及其核心靶点、重要成分的筛选 为了解百合疏肝安神汤的具体作用机制，将共同基因导入STRING 11.5，限制物种为“Homo sapiens”，置信度为中等0.04，以此获取PPI 关系。 再将各参数以tsv文件导入Cytoscape 3.8.0（https://cytoscape.org/），对节点度值进行分析，确定百合疏肝安神汤治疗焦虑性抑郁症的核心靶点，进而得到对应的重要化学成分。

1.2.4 生物过程和通路分析 为了解核心基因的功能以及在信号通路中的作用，将共同靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），物种限制为“Homo sapiens”，阈值设定P＜0.05，进行基因本体论（gene ontology, GO）功能和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析，再借助ImageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/index）和GraphPad Prism 7.0 将结果可视化。

1.2.5 “活性成分-核心靶点-重要通路”网络的构建 将结果所得的成分、靶点、通路等信息在Excel中建立三者的数据文件和属性文件，导入Cytoscape 3.8.0 软件，构建“活性成分-核心靶点-重要通路”网络。

2 结果

2.1 百合疏肝安神汤主要化学成分

通过UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术分析得到百合疏肝安神汤总离子流图，见图1。 经文献对比，完成色谱峰对应化合物的定性分析，得到78 个化合物，主要包括精氨酸、葡萄糖酸、柠檬酸、异柠檬酸、郁金香苷A 等。 详见表1。

表1 百合疏肝安神汤主要化学成分

续表1

图1 百合疏肝安神汤正负离子模式总离子流图谱

2.2 药物及疾病共同基因的筛选

利用TCMSP 检索得到药物靶点144 个，去除重复基因后有101 个；通过GeneCards 检索所得疾病靶点1338 个，无重复基因。将二者上传至Venny 2.1.0匹配映射后，获取共同靶点52 个。 详见图2。

图2 百合疏肝安神汤中化合物及其与焦虑性抑郁症相关靶点的交集基因

2.3 PPI 网络的构建与分析

借助STRING 11.5 数据库构建PPI，共得到11个节点和644 条边，见图3。 将共同靶点及对应成分导入Cytoscape 3.8.0，对网络中各个节点的度值大小进行比较分析，节点的平均度值为58.55，以大于等于两倍中心平均度值为标准，得到治疗焦虑性抑郁症作用靶点8 个， 分别为CAT、IL-1β、PTGS2、IL-6、INS、CASP3、SRC、MYC，见表2，对应化合物14 个，具体见表3。

表2 拓扑分析8 个核心靶点信息

表3 拓扑分析14 个重要化合物信息

图3 百合疏肝安神汤与焦虑性抑郁症PPI 核心网络

2.4 生物过程和通路富集分析

DAVID 中GO 功能富集分析中获得的GO 条目共252 个（P＜0.05），其中包括生物过程（biological process, BP）条目181 个，涉及对药物的反应、一氧化氮生物合成过程的正向调节、细胞对雌二醇刺激的反应等；细胞组成（cellular component, CC）条目31 个，涉及神经元投影、细胞溶质、膜式筏板等；分子功能（molecular function, MF）条目40 个，涉及血红素结合、NADP 绑定、蛋白质同型二聚体活性等。该结果中BP、CC 和MF 分别占71.8%、12.3%和15.8%，运用GraphPad Prism 7.0 对GO 功能富集分析结果进行可视化处理，结果见图4。

图4 百合疏肝安神汤活性成分潜在靶点的GO 功能富集分析

KEGG 通路富集结果经过滤选择共获得82 条信号通路（P＜0.05），涉及HIF-1 信号通路、PI3KAkt 信号通路、NF-κB 信号通路等。运用ImageGP 对富集分析结果进行可视化处理。 详见图5。

图5 百合疏肝安神汤活性成分潜在抗焦虑性抑郁症靶点的KEGG 代谢通路富集分析

2.5 百合疏肝安神汤“活性成分-核心靶点-重要通路”网络

百合疏肝安神汤“活性成分-核心靶点-重要通路”网络如图6 所示。 该网络中共涉及30 个节点（包括12 个化合物节点、8 个靶点节点、10 个通路节点）和156 条边，平均相邻节点数目为5.20。 结果表明百合疏肝安神汤中存在化合物与多个靶点相互作用的机制，同时存在几种化合物同时扩散至同一靶标的过程，最后作用于多种通路。

图6 百合疏肝安神汤“活性成分-核心靶点-重要通路”网络

3 讨论

本研究通过UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术分析了百合疏肝安神汤的78 种活性成分，其中肉豆蔻醚、芦丁、紫堇定碱等度值较大，且与核心靶点有较强的关联性，表明其可能为百合疏肝安神汤治疗焦虑性抑郁症的重要活性成分。有研究指出，肉豆蔻醚表现出明显的抗抑郁性质，其依赖于5-HT 功能的调节，抑制5-HT2A 受体活性达到缓解抑郁的作用[8-9]。 芦丁是一种天然黄酮苷，属于黄酮类化合物，研究表明其能够增加大鼠进入高架十字迷宫开放臂的次数与时间，发挥抗焦虑作用[10]。 同时，黄酮类化合物能抑制单胺氧化酶活性，影响5-HT 的重吸收，起到抗抑郁的作用[11]。研究显示，阿朴啡类生物碱具有抗氧化作用[12]，其机制可能通过对抗自由基络合或者主动捕获自由基的方式，阻止机体内脂质过氧化，进而发挥抗焦虑抑郁作用[13]。

由“活性成分-核心靶点-重要通路”网络可知，PTGS2、IL-6、IL-1β 与PI3K-Akt 信号通路、NF-κB信号通路相连成分较多，可能为抗焦虑性抑郁症的潜在靶点与通路。

PTGS2 又名环氧合酶2，是花生四烯酸合成前列腺素类物质的关键性限速酶，其含量高低能够影响海马、杏仁核等脑区的功能，可能参与焦虑性抑郁症的病理进程[14]。PI3K-Akt/NF-κB 信号通路对于细胞的增殖、分化、凋亡、炎症的发生等发挥着不容忽视的作用[15]。PI3K-Akt 信号通路可与NF-κB 信号通路产生交叉反应，在一定程度上对其活性进行调节[16-17]。DOU 等[18]研究发现，PI3K-Akt 信号通路可能通过活化核转录因子进入细胞核，促进细胞增殖，抑制凋亡，进而达到抗焦虑性抑郁症的作用。 同时，PI3KAkt 信号通路还可以通过增强NF-κB 抑制蛋白IκB激酶的磷酸化和降解，继而导致NF-κB 的活化，诱导促炎因子(如TNF-α、IL-6 和IL-1β)释放[19]。因此，百合疏肝安神汤可能通过介导PI3K-Akt、NF-κB 信号通路，抑制海马细胞凋亡或促炎因子过量分泌来实现抗焦虑性抑郁症作用。

综上所述，本研究在百合疏肝安神汤化学成分的测定分析基础上，利用网络药理学的分析方法，分析了百合疏肝安神汤14 种重要活性成分、8 个抗焦虑性抑郁的潜在作用靶点，可能通过肉豆蔻醚、芦丁、紫堇定碱等活性成分作用于PTGS2、IL-6、IL-1β等潜在靶点，通过调控PI3K-Akt、NF-κB 等信号通路，在神经元投影、细胞溶质、膜式筏板等区域参与对药物的反应、一氧化氮生物合成过程的正向调节、细胞对雌二醇刺激的反应、血红素结合、NADP绑定、蛋白质同型二聚体活性等过程，发挥抗焦虑性抑郁症作用。