隔药饼灸对高脂血症兔IGF-1/Sp1 蛋白及基因表达的影响

李 芊，欧阳里知，刘惠娟，彭 涵，刘红华，葛君芸，常小荣，刘迈兰*

（1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学护理学院，湖南 长沙 410208）

高脂血症（hyperlipidemia, HLP）是因机体脂质转运或代谢异常而引起的血液中甘油三酯（riglyceride,TG）水平和（或）总胆固醇（total cholesterol, TC）水平、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）过高，和（或）高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）水平过低的一种病症，是动脉粥样硬化等心血管事件的重要危险因素。隔药饼灸是通过艾灸与中药的结合，共同刺激腧穴治疗疾病的针灸特色疗法。 临床试验与基础实验研究表明，隔药饼灸能降低LDL-C、升高HDL-C 和升高高密度脂蛋白与胆固醇的比值，肯定了隔药饼灸的降脂调脂效果[1-2]。 胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）是参与调节HLP的重要的机制之一[3]，而胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor 1, IGF-1）、特异性蛋白1（specificity protein 1, Sp1）在RCT 过程中起着重要的调控作用[4-5]。IGF-1 是防止LDL-C 水平升高的一个保护因素，保持一定的IGF-1 水平可以调节血液LDL-C 浓度[6]。下调IGF-1 的mRNA 表达，可介导RCT，对HLP 起到治疗作用[4]。Sp1 通过增强肝细胞代谢体内胆固醇的能力，促进RCT 过程，调节血液中LDL-C 与HDL-C的水平[5]。本次研究以HLP 兔为研究对象，运用隔药饼灸干预治疗，探讨隔药饼灸的血脂调节机制是否通过IGF-1/Sp1 通路，调节RCT 和HLP 进程。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性新西兰兔36 只，体质量1.5～2.5 kg，购自湖南太平生物有限公司[普通级，许可证号：SCXK(湘)2020-0005]，单笼兔圈养于湖南中医药大学实验动物中心，饮水不限，喂食定量。 饲养环境以明暗灯光模拟昼夜交替过程，湿度50%～70%，温度20～25 ℃。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 台式高速冷冻离心机（型号：75007685，美国赛默飞世尔科技公司）；全自动生化分析仪（型号：Chemray 120，深圳雷杜生命科学股份有限公司）；高速低温离心机（型号：D3024R，SCILOGBX公司）；GloMax 酶标仪（型号：GM3030，Promega 公司）；振荡仪（型号：10RTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；超微量分光光度计（型号：NanoVue Plus, NannoVue 公司）；基因扩增仪（型号：ETC811，苏州东胜兴业科学仪器有限公司）。

1.2.2 主要试剂 TG 检测试剂盒（批号：20200507）、LDL-C 检测试剂盒（批号：20200619）、TC 检 测 试 剂盒（批号：20200526）均来自深圳雷杜生命科学股份有限公司；蛋白酶抑制剂（批号：04693132001，Roche）；磷酸酶抑制剂（批号：04906837001，Roche公司）；RNA 提取试剂盒（批号：RN03，艾德莱生物技术有限公司）；逆转录试剂盒（批号：FSQ-101，TOYOBO）；IGF-1 ELISA 试剂盒 （批号：JL17113，上海江莱生物科技有限公司）；Sp1 ELISA 试剂盒（批号：SY-00967，上海双赢生物科技有限公司）。

1.3 HLP 模型制备与评定

采用外源性高胆固醇、高脂饮食诱导法[7]制备HLP 模型，高胆固醇和高脂饮食饲料配方为84%基础饲料（实验兔专用）、10%蛋黄粉、5%猪油、1%胆固醇。 造模期间每只实验兔单笼饲养，饮水不限，饲料喂养120～150 g/只，连续8 周（56 d）。

HLP 模型制备：适应性喂养1 周后，各组实验兔行耳中动脉采血，检测造模前各组血脂水平（血清TC、TG、LDL-C），记录正常血脂水平并评估各组间的造模前基线。 自第2 周起，各模型制备组以高胆固醇、高脂饲料喂养，正常组以普通实验兔专用基础饲料喂养，在造模8 周后行耳中动脉采血，造模后测各组血脂水平，对比造模前与造模8 周后组间血脂水平及各组造模8 周血脂变化。

模型评定：新西兰兔正常血清TC含量为1～2 mmol/L，当造模各组血清TC 值高于此值（或正常组TC值）3倍以上，血清TG 和LDL-C 含量与正常组相较升高（P＜0.05），则判定HLP 模型成立[7]。

1.4 干预方法

所有实验兔在适应性喂养1 周后，分为正常组、模型组、隔药饼灸组，每组12 只。 除正常组喂食基础饲料外，其余2 组每天喂食高胆固醇、高脂饲料，持续8 周，制备HLP 兔模型。造模成功后，各组均喂食普通饲料。 每天上午7:00，正常组和模型组予以单纯捆绑操作；隔药饼灸组在捆绑固定于兔台后予以隔药饼灸操作，干预30 min。 各组干预持续8 周，各实验兔每天总食量120～150 g/只。 分别在造模前（适应性喂养1 周后）、造模8 周后经兔耳中动脉采血，干预8 周后腹主动脉采血，4 ℃静置2 h 后以3000 r/min，半径168 mm，离心10 min，取上清，检测血脂水平。

隔药饼灸操作：模型制备成功后，实验兔腧穴部位剃毛处理，固定于兔台，取穴定位，局部聚维酮碘消毒，涂抹凡士林，在穴位敷上新制作的药饼，医用镊子夹持中等强度艾炷点燃，放置于药饼上方施灸，每穴需连灸4 壮，每壮需彻底燃烧后再更换，两组穴位交替施灸，每天1 组穴位，连灸8 周，每灸6 d 休息1 d。 施灸穴位分为腹背2 组：腹组取“巨阙”和双侧“天枢”“丰隆”；背组取双侧“脾俞”“肝俞”“心俞”。取穴方法参考余曙光、徐斌主编的《实验针灸学》[8]及拟人比照法制定。 药饼制作方法：选取大黄、泽泻、郁金、山楂、丹参，按1∶1 打磨机粉碎为末；在每次施灸之前，将粉末以醋调成糊状，捏压成直径1 cm 左右、厚约5 mm 的药饼。

1.5 指标采集与检测

1.5.1 指标采集 20%乌拉坦耳缘静脉注射4 mL/kg麻醉实验兔，腹主动脉取血5 mL，3000 r/min 离心15 min，取上清。 剪取主动脉一段，取3 mm×3 mm×5 mm 肝组织分别在无菌培养皿内PBS 冲洗血液后，放入冻存管。 上述标本均于-80 ℃冰箱保存待测。

1.5.2 血脂检测 使用全自动生化仪Rayto-Chemray120 测实验兔血清中TC、TG 和LDL-C 的含量。

1.5.3 ELISA 法检测血清中IGF-1、Sp1 的含量 （1）取出血清样品，置于冰上融化，待融化完毕后，震荡摇匀。 （2）将IGF-1、Sp1 标准品于10 000 r/min 下离心1 min，然后加入标准品1 mL 稀释液于标准管中，旋紧管盖，静置10 min，上下颠倒数次，使其充分溶解混匀后，配制成不同浓度的标准品。 然后根据需要进行2 倍比稀释，配制出不同浓度的标准品。 （3）取不同浓度标准品50 μL 加入标准孔，另加入其他孔50 μL 待测样品。 用封板膜封后放置于37 ℃烘箱中培育90 min。 弃液，甩干，于每孔中加入100 μL 生物素化抗体工作液，混匀，再以封板膜封后置于37 ℃烘箱中培育60 min。 甩尽孔内液体，于每孔加350 μL洗涤液，浸泡1～2 min，甩掉酶标板内的液体，重复洗板步骤5 次。 每孔加100 μL 酶结合物工作液，加上覆膜，用封板膜封后置于37 ℃烘箱中培育30 min。弃液，甩干，洗板5 次。 每孔加底物溶液三甲基苯90 μL，用封板膜封后置于37 ℃烘箱中培育15 min。每孔加50 μL 终止液，终止反应。 （4）在450 nm 波长下测量各孔的吸光度（OD 值）。在加终止液后15 min以内进行测定。最后根据所得标准曲线，计算每个组织指标含量。

1.5.4 RT-PCR 法测主动脉IGF-1 的mRNA 表达量和肝组织IGF-1、Sp1 的mRNA 表达量 （1）β-actin、IGF-1 和SP1 共3 对RT-PCR 引物的设计（见表1）。（2）RNA 提取：分别取主动脉、肝脏样品100 mg 加液氮研磨；取Trizol 1 mL 室温下裂解5 min，在4 ℃、12 000 r/min 下离心10 min；取上清，每1 mL 裂解液中加入氯仿0.2 mL，震荡15 s，室温孵育3 min，于4 ℃、12 000 r/min 下离心10 min，样品分3 层后，取最上层，记录其水相体积；加与水相体积一半的乙醇，混匀转移至吸附柱，以12 000 r/min 离心45 s；加去蛋白液500 μL 再以12 000 r/min 离心45 s，加500 μL 漂洗液洗两次，12 000 r/min 离心45 s；用100 μL 水洗脱RNA，微量酶标仪测定RNA 浓度。（3）RNA 逆转录：每个样品取1 μg 进行逆转录，配制逆转录体系。（4）RT-PCR 上机检测进行程序扩增。琼脂糖凝胶电泳检测：分别于每个样品中取1.5 μL在1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳10 min，使用凝胶成像仪成像。

表1 β-actin、IGF-1 和Sp1 引物信息表

1.6 统计学方法

所有数据在SPSS 25.0 中进行统计分析。 RTPCR 检验统计方法为多组One-way ANOVA 法。 当计量资料不满足正态分布时，多组间比较选择非参数秩和检验—K 个独立样本Kruskal Wallis 检验，以“M（IQR）”表示，当组间差异有统计学意义时则行多重比较，以“±s”表示。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组实验兔血清中TC、TG、LDL-C 的含量比较

造模前，各组血清中TC、TG、LDL-C 含量水平差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。造模后，模型组与隔药饼灸组的TC 值均高于正常组（P＜0.05），表明造模成功。 造模后，正常组因腹泻死亡1 只，隔药饼组因骨折后感染死亡1 只。干预后，模型组因腹泻死亡1 只、体表脂肪瘤破溃感染死亡1 只，隔药饼灸组因捆缚固定致伤口感染死亡2 只。

造模后，模型组、隔药饼灸组与正常组比较，血清中TC、TG、LDL-C 含量升高（P＜0.05）；隔药饼灸组与模型组比较，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。干预后，模型组、隔药饼灸组与正常组比较，血清中TC、TG、LDL-C 含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，隔药饼灸组血清中TC、TG、LDL-C 含量降低（P＜0.05）。详见表2。

表2 各组实验兔造模前、造模后、干预后TC、TG、LDL-C 含量比较[M（IQR），mmol/L]

2.2 各组实验兔血清中IGF-1、Sp1 蛋白含量比较

干预后，与正常组比较，模型组血清中IGF-1、Sp1 含量上升（P＜0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组血清中IGF-1、Sp1 含量下降（P＜0.01）。 详见表3。

表3 各组实验兔血清中IGF-1、Sp1 蛋白含量比较（±s）

表3 各组实验兔血清中IGF-1、Sp1 蛋白含量比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

分组正常组模型组隔药饼灸组n 11 10 9 IGF-1/（pg/mL）91.86±37.24 212.40±61.56**127.66±18.42##Sp1/（μg/mL）2.91±0.75 5.73±2.25**3.72±0.71##

2.3 各组测实验兔主动脉IGF-1 的mRNA 表达量比较

与正常组比较，模型组主动脉IGF-1 的mRNA表达量明显上升（P＜0.001）；与模型组比较，隔药饼灸组IGF-1 的mRNA 表达量明显下降（P＜0.01）。 详见表4。

表4 各组实验兔主动脉IGF-1 的mRNA 表达量比较（±s）

表4 各组实验兔主动脉IGF-1 的mRNA 表达量比较（±s）

注：与正常组比较，***P＜0.001；与模型组比较，##P＜0.01。

分组正常组模型组隔药饼灸组n 11 10 9 IGF-1/（pg/mL）1.00±0.06 2.69±0.15***2.07±0.27##

2.4 各组实验兔肝组织IGF-1、Sp1 的mRNA 表达量的比较

与正常组比较，模型组肝组织IGF-1、Sp1 的mRNA 表达量显著上升（P＜0.001、P＜0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组IGF-1、Sp1 的mRNA 表达量均明显下降（P＜0.01）。 详见表5。

表5 各组实验兔肝组织IGF-1、Sp1 的mRNA表达量比较（±s）

表5 各组实验兔肝组织IGF-1、Sp1 的mRNA表达量比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，##P＜0.01。

分组正常组模型组隔药饼灸组n 11 10 9 IGF-1/（pg/mL）1.00±0.14 3.34±0.19***2.13±0.18##Sp1/（μg/mL）1.00±0.34 2.16±0.26**1.05±0.18##

3 讨论

HLP 是由于体内脂质代谢紊乱导致脂质水平异常的代谢性疾病。 血脂的异常明显受饮食及生活方式的影响，饮食治疗和生活方式的改善是治疗血脂异常的基础措施[9]。故本研究在高脂饮食造HLP兔模型成功后，将模型组和隔药饼灸组更换为普通饲料喂养，观察饮食方式的改变对HLP 模型兔的影响。 更换为普食后，与高脂饮食造模后相比，模型组与隔药饼灸组TC、LDL-C 水平均有下降，虽然差异无统计学意义，但可继续关注饮食生活方式对血脂异常的影响，做进一步的研究。 隔药饼灸能够将穴位刺激作用、 中药药理作用和艾灸温热作用结合，是课题组临床试验与基础研究多年的成果，其选取心俞、脾俞、肝俞和巨阙、天枢、丰隆作为主要施灸穴位[10-11]。 巨阙，为心之募穴，理气宽胸止痛。 心俞，主强心通脉活血。 丰隆、脾俞、肝俞和天枢4 穴共用，为辨证配穴，旨在健脾疏肝畅胃肠。 上述6 穴共用，起到活血逐瘀、疏肝理气及健脾祛痰之效。 课题组前期关于RCT 机制研究表明， 隔药饼灸可通过增加肝过氧化酶体增殖物激活型受体（peroxisome proliferator-activated receptors, PPAR）γ 的表达、诱导清道夫受体B 类1 型（scavenger receptor class B member 1, SR-B1）表达[12]；可抑制拉斯同源家族成员A/RhoA 相关螺旋激酶1（ras homolog family member A/Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1, RhoA/ROCK1）mRNA 表达，激发肝脏X 受体（liver X recepter, LXR）mRNA 表达[13]；可 能 增 强肝脏RCT 核受体LXRα 的表达[14]，从而促进RCT，调节血脂发挥抗动脉粥样硬化的作用。

本实验在高脂高胆固醇饮食造模8 周后，与正常组比，模型组与隔药饼组血清TC、TG、LDL-C 含量均升高，并且TC 值高于正常组TC 值3 倍以上，血清TG 和LDL-C 含量与正常组相较升高，说明HLP模型造模成功。 隔药饼灸干预8 周后，与模型组比较，隔药饼灸组TC、TG、LDL 含量均下降，其中TG含量下降至正常值水平，与前期研究一致[1]，肯定了隔药饼灸的降脂疗效。本研究发现，隔药饼灸组与模型组比较，下调了HLP 兔血清中IGF-1、Sp1 的蛋白含量，下调了主动脉IGF-1 的mRNA 和肝组织IGF-1、Sp1 的mRNA 表达量。

IGF-1 结构与胰岛素相似，是由70 多个氨基酸组成的单链多肽，参与体内蛋白、糖、脂质等代谢，可以在生物体内的心脏、肝脏等多组织器官中检测到[4]。 IGF-1 通过特异性结合靶细胞表面IGF-1 受体而发挥生物学效应，促进肝脏及肌肉对外源性氨基酸和葡萄糖的摄取，促进脂肪动员[15]。 IGF-1 是防止LDL-C 水平升高的一个保护因素，保持一定的IGF-1水平可以调节血清LDL-C 浓度[6]。 IGF-1 缺陷的小鼠表现出脂质代谢相关基因和参与肝脏中胆固醇合成酶的表达失调[16]。 IGF-1 潜在的促动脉粥样硬化作用能增强LDL 的摄取和胆固醇酯化[17]。 有研究发现，TC、LDL-C、HDL-C 和TG 随着IGF-1 皮质醇水平的上升而增加[18]。电针丰隆穴能通过下调IGF-I的mRNA 表达，从而介导RCT[4]。 RCT 是通过LDL-C 将其携带的胆固醇转运到外周组织细胞，通过HDL-C将其携带的胆固醇从外周组织细胞转运回肝脏进行消除的过程[19]。 低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor, LDL-R）负责RCT 介导HDL-C和LDL-C 分别从血液中摄取[20]。 本研究发现，与模型组比较，隔药饼灸组下调了HLP 兔血清中IGF-1 的含量，下调了主动脉、肝组织IGF-1 的mRNA表达量。故推测隔药饼灸通过下调血清中IGF-1 的含量，下调组织中IGF-1 的mRNA 表达量，调节对LDL-C的摄取，从而参与RCT 过程，发挥血脂调节作用。FRIEDRICH等[21]提出血清IGF-1是多发性硬化发展的风险预测因素。 更有研究表明血清IGF-1 和心血管疾病之间存在U 型关系，高和低水平IGF-1 均可预测心血管疾病死亡率[22]。 因现有研究关于IGF-1 与人类代谢疾病关系存有争议与矛盾，故根据“U型关系理论”，IGF-1 水平过低或过高均可预测心血管疾病死亡率，推测隔药饼灸通过将IGF-1 水平下调至生理最优区间水平，从而起到调节血脂代谢的作用。

Sp1 属于Sp 蛋白家族(Sp1～Sp9)，能通过结合这些基因调控区的GC/GT 区以及通过磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化等多种翻译后修饰，发挥对基因转录的促进/抑制作用和调控编码蛋白活性的作用[23]。Sp1 转录因子在与脂肪酸合成相关的基因转录中发挥重要作用[24]，而这些基因对于维持脂肪组织的稳态具有重要意义[25-26]。LDL-C 水平的升高会促进Sp1磷酸化来增加RCT 过程中的关键蛋白SR-B1 在肝脏中的表达，从而加速血浆中HDL-C 摄取进入肝细胞的RCT 过程[19]。 同时，Sp1 和SR-B1 协同激活LDL-R 启动子，上调肝细胞中LDL-R，降低血液LDL-C水平[27]。前期研究表明，隔药饼灸可以通过诱导SRB1 表达，促进RCT 调节血脂[12]。本研究中，与模型组比较，隔药饼灸组下调了HLP 兔血清中Sp1 的含量，下调了肝组织Sp1 的mRNA表达量。 故推测隔药饼灸能够下调HLP 模型兔Sp1 含量与表达，协同激活SR-B1，调控肝细胞中LDL-R，降低血液LDL-C 水平，促进RCT。富含GC 的区域内的Sp1 位点可能是IGF-1 受体信号传导的靶标[28]。 胰岛素增加了Sp1与IGF-1 基因启动子的结合[29]。Sp1 结合活性升高诱导IGF-1 增强了酪酪肽转录，介导热量营养的摄入；IGF-1 增加了Sp1 蛋白水平，而用IGF-1 受体抗体阻断IGF-1 受体后可抑制Sp1 蛋白水平的升高[30]。所以Sp1 可通过结合IGF-1 受体基因调控区的GC/GT 区，激活IGF-1 信号通路。 Sp1 转录因子是IGF-1作用的一个关键介质，它通过激活P450 侧链裂解酶（P450scc）基因的表达[31]，介导类固醇生成作用[32]。 故Sp1 转录因子通过介导IGF-1 诱导P450scc 基因的表达介导类固醇物质的生成[33]，激活IGF-1/Sp1 信号通路，从而调节胆固醇物质的生成与转化。

综上所述，隔药饼灸通过下调血清中IGF-1 的含量，下调组织中IGF-1 的mRNA 表达量，调节对LDL-C 的摄取；通过下调Sp1 含量与表达，调控肝细胞中LDL-R，降低血液LDL-C 水平，促进RCT。所以IGF-1 和Sp1 通过调节对LDL-C 的摄取，参与RCT 过程。 故推测隔药饼灸影响IGF-1/Sp1 信号通路，通过RCT 环节，调节LDL-C 的摄取和转运，从而缓解HLP。