针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织铁死亡的影响

汪红娟，唐 红，江姗姗，李展富，吕倩忆，田浩梅，陈楚淘*

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

脑血管病是严重危害人类生命安全并具有多方面损伤的疾病，国外调查研究指出，缺血性脑卒中（ischemic stroke, IS）占所有脑血管意外疾病的87%[1]。 临床上，针对IS 常通过溶栓治疗恢复缺血侧血液循环，然而IS 发生一段时间后重新获得血液供应时，缺血性损伤有可能不会逆转反而进一步加重，出现更严重的脑组织损伤现象包括神经细胞死亡等，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）[2]。 铁死亡是一种特殊的新型细胞死亡方式，与细胞自噬、坏死等其他死亡方式有所区别，它是由于细胞内铁离子、活性氧（reactive oxygen species, ROS）等有关代谢产物过量沉积，出现的脂质过氧化反应[3]。 铁死亡与缺血再灌注损伤、肿瘤、神经退行性疾病和肾功能损伤等许多疾病联系密切[4]。 研究表明，CIRI 后会出现细胞内铁离子水平升高和脂质过氧化物增多，而降低铁离子水平，可改善脑梗死症状、减轻缺血后的神经损伤[5-6]。 前期课题组研究证明，针刺督脉穴“大椎”“人中”“百会”对CIRI 大鼠脑组织具有一定程度的神经保护作用，其机制与多蛋白、多基因、多信号通路抑制细胞凋亡有关[7]。 故针刺是否可通过调节铁离子代谢和脂质过氧化，来抑制神经细胞铁死亡抗CIRI 值得研究。 因此，本研究通过检测大鼠缺血侧海马组织铁离子、ROS 和脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，观察铁沉积情况，阐明针刺对CIRI大鼠的脑保护效应及铁死亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

65 只健康SD 大鼠，体质量210～230 g，由湖南中医药大学SPF 级实验动物中心代替购买，合格证号：SCXK(湘)2019-0004。 所有大鼠在湿度50%～60%、温度22～24 ℃、灭菌饲料饮食及纯净水条件下饲养。大鼠普通喂养3 d 后，随机选取20 只作为假手术组，其余进行造模，造模成功后再随机分为模型组、药物组、针刺组，其中药物组5 只，模型组和针刺组各20 只。

1.2 主要试剂及仪器

水合氯醛（批号：B1826028，上海阿拉丁生化科技有限公司）；依达拉奉（批号：19031211，南京海陵药业有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl-2h-tetrazolium chloride, TTC）染液（批号：G3004，北京索莱宝科技有限公司）；4%多聚甲醛（批号：WB0401，长沙维尔生物科技有限公司）；组织铁试剂盒（批号：A039-2-1，南京建成有限公司）；ROS试剂盒（批号：FY3686-B，江苏酶免实业有限公司）；MDA 试剂盒（批号：A003-1，南京建成有限公司）。

线栓（型号：A4-263450，北京西浓科技有限公司）；无菌针灸针（型号：0.25 mm×13 mm，贵州安迪医疗器械有限公司）；酶标仪（型号：SMR60047，USCNK 公司）；离心机（型号：80-2、常州峥嵘仪器有限公司）；恒温水浴锅（型号：HHS-2，上海南阳仪器有限公司）。

1.3 动物造模

采用Zea Longa 改良线栓法[8]制备CIRI 模型。造模前12 h 动物禁食但不禁水，麻醉使用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射，仰卧位将麻醉好的大鼠固定于手术板上，手术部位备皮后消毒，用剪刀于颈前正中线向右稍旁开处作长纵向切口，用镊子层层分离颈内动脉(internal carotid artery, ICA)、颈总动脉(common carotid artery, CCA)及颈外动脉(external carotid artery, ECA)。 将ECA、CCA 近心端永久性结扎，在CCA 结扎部位上方2～3 mm 处用眼科剪向上剪一小斜开口，用镊子夹持线栓球端由开口处从CCA 插入至ICA，确认线栓黑色记号点（19 mm）已过ICA、ECA 分叉部遇阻力即停止推进，防止出血，立即结扎ICA 细线，缝合伤口并使用青霉素抗炎处理以防感染。 脑缺血2 h 且模型成功后，将体外的线栓扯出10 mm 左右[9]，完成CIRI 模型。 假手术组不剪血管不插线栓，按步骤只需要做到暴露血管。 待大鼠苏醒后，参考Zea Longa 五级四分法[8]测定模型是否成功，1～3 分者纳入实验分组。本实验造模大鼠的死亡率约为20%，当实验大鼠数量不足时，则按实验设计方案进行补充。

1.4 干预方法

待大鼠生命体征稳定后，药物组采用依达拉奉水溶液腹腔注射（5 mg/kg）后捆绑30 min；假手术组、模型组注射等同药物剂量生理盐水并捆绑30 min；针刺组注射等同药物剂量生理盐水并根据大鼠实验图谱[10]、《实验针灸学》[11]及比照人体定位法，选取督脉“大椎”“人中”“百会”3 穴进行捆绑针刺。 大椎直刺5 mm，人中斜刺2 mm，百会平刺2 mm，每个穴位刺激捻转1 min，平补平泻，中间行针1 次，留针0.5 h。 均1 次/12 h，共7 次。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 神经功能缺损评分 CIRI 模型大鼠生命体征稳定后，在治疗前进行第1 次评分，参照改良Garcia 评分法[12]从大鼠自主运动、前肢伸展、体态、攀爬、胡须及身体碰触反射6 个方面进行评估，待7 次治疗结束后进行第2 次评分。

1.5.2 TTC 染色检测 干预结束后，断头取全脑于-20 ℃冰箱冷冻15 min，冻好取出后全程在冰上操作，去除嗅球部分和小脑后沿冠状面切成5 片，每片约2 mm，完成后立即将切片放入配好的2% TTC中，于37 ℃恒温水浴锅中避光染色20 min，期间可用勺子翻面或轻微摇晃2 次。 结束后使用4%多聚甲醛固定1 d，拍摄照片，存入电脑。 切片可见正常组织呈现红色，而缺血侧组织出现白色梗死现象。应用Image-Pro plus 6.0 软件测量切片的缺血侧总面积和梗死区域面积，梗死面积比参照Swanson 法[13]进行计算。

1.5.3 ROS、铁离子、MDA 含量检测 将缺血侧海马组织匀浆，按标本处理的要求步骤进行离心、上样等操作，然后分别在450 nm、520 nm 及532 nm 波长下用酶标仪测定检测样品的吸光度，根据公式计算ROS、铁离子、MDA 含量。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

干预前，相比于假手术组，其余各组改良Garcia评分降低（P＜0.01），说明造模成功；各造模组之间改良Garcia 评分差异无统计学意义（P＞0.05）。干预后，相比于模型组，针刺组、药物组改良Garcia 评分均升高（P＜0.05），说明两种治疗均有效；药物组与针刺组评分差异无统计学意义（P＞0.05）。 干预后，针刺组、药物组较干预前改良Garcia 评分均上升（P＜0.05）。详见图1。

图1 各组大鼠改良Garcia 评分比较［M（QR）］

2.2 各组大鼠脑梗死面积比较

假手术组大鼠切片无白色梗死区域，相比于假手术组，其他3 组大鼠切片白色梗死区域增加（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组、药物组白色梗死区域减小（P＜0.01 或P＜0.05）；药物组与针刺组之间梗死面积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见图2。

图2 TTC 染色图及脑梗死面积比比较（±s，n=5）

2.3 各组大鼠海马区ROS、铁离子、MDA 含量变化

与假手术相比，模型组大鼠ROS、铁离子、MDA含量显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组大鼠ROS、铁离子、MDA 含量明显下降（P＜0.01）。 详见图3。

图3 海马区ROS、铁离子、MDA 含量变化（±s，n=5）

3 讨论

IS 是脑血管病中最多见的类型，其临床症状与中风相似，因而将其归属于中医学“中风”范畴。 古籍早有文献记载运用针刺治疗中风，如《灵枢·热病》曰“偏枯，身偏不用而痛……巨针取之……”，就阐述了运用九针中的巨针可以治疗中风中经络之半身不遂的症状。中风的发病部位在脑，古有“病变在脑，首取督脉”之说，故治疗多以针刺督脉穴为主。 大椎为“三阳督脉之会”,百会为百脉汇聚之处,人中居口鼻之间可调神导气，三穴皆位于督脉，配合使用可达补脑生髓、醒脑开窍、调和气血之功。 另有《普济方·针灸》云“治中风，气塞涎上……百会、风池、大椎……等七穴”，《针灸大成·玉龙歌》提及“中风之病症非轻……再刺人中立便轻”， 亦显示古代医家治疗中风多选取人中、百会、大椎等穴位。 课题组前期研究表明，针刺人中、大椎、百会穴可有效减轻脑缺血后2 h 再灌注损伤大鼠神经功能损伤， 改善神经元线粒体超微结构的病理变化，促进血管新生，减少脑梗死面积，从而达到一定程度的脑保护作用[14-15]。

铁死亡与铁离子依赖有关的脂质过氧化有着密切关系[5]，引起铁死亡的原因有很多，涉及多条通路，包括铁离子、氨基酸和脂质过氧化等代谢异常及氧化损伤，研究发现引起铁死亡的主要原因是细胞内铁离子超载和脂质过氧化[16]。正常情况下，铁离子代谢在生物体内处于一个动态平衡状态，细胞外的铁离子可以被转铁蛋白及其载体转铁蛋白结合受体摄入，通过膜铁转运蛋白输出，或以铁蛋白的形式储存在体内。 在缺血、缺氧等应激条件下，铁离子代谢失衡，致使细胞内铁离子处于超载状态，而过量的铁离子可以通过Fenton 反应与过氧化氢产生脂质ROS 和强氧化剂羟基自由基[17-18]，增加氧化应激水平。正常人体产生的ROS 在组织稳态和细胞信号转导中起重要作用，但在异常情况下产生过量则会对细胞成分如蛋白、脂质等产生不利的氧化损伤[19-20]。铁离子可以催化脂质过氧化，是脂氧合酶催化亚基的重要组成部分，当细胞无法通过抗氧化机制有效清除细胞内ROS 时，也可以导致脂质过氧化物MDA在细胞内的过度累积[21-22]，从而加重细胞的损伤，促使细胞死亡。

目前，研究发现多种细胞死亡方式在CIRI 中可以被激活，其中凋亡、坏死和自噬相关的细胞死亡被认为是导致CIRI 的关键因素[23-24]。但是，也有研究发现，在大鼠和小鼠脑缺血模型中，缺血损伤侧脑组织中出现铁离子水平的升高，并且这种铁离子的过度蓄积可引发铁死亡[25]。且研究表明，CIRI 后除了出现大量铁离子沉积，还会导致自由基的产生，而使用铁死亡抑制剂去铁酮可以减少铁离子聚集，改善神经功能损伤[26]。

依达拉奉是常用的IS 治疗药物，是一种氧自由基清除剂，研究发现依达拉奉可以改善大鼠CIRI 后神经功能损伤、抗氧化应激反应，具有脑保护作用[27-28]，因此，本实验采用依达拉奉作为药物对照组，观察针刺的脑保护效应。实验结果说明，造模后各组大鼠白色梗死区域扩大，神经功能出现不同程度缺损，说明模型制备成功；针刺组、药物组梗死区域缩小，神经功能缺损评分较模型组上升，说明两种干预方式皆有效果。模型组较假手术组大鼠海马组织铁离子水平明显增高，ROS、MDA 含量亦明显升高，提示可能随着铁离子含量的增多，会导致细胞内大量ROS和脂质过氧化物MDA 的累积，促使铁死亡的发生。针刺组较模型组铁离子、ROS 以及MDA 的含量明显降低，提示针刺有可能通过减少铁离子、ROS及MDA 含量，降低脂质过氧化水平，抑制铁死亡的发生，达到抗CIRI 的作用。 虽然本实验结果揭示了针刺可以通过抑制铁死亡减轻CIRI 和发挥神经保护作用， 但针刺抑制CIRI 后铁死亡中铁超载和脂质过氧化哪一环节起主导作用及具体的调控机制尚不清楚，是下一步的研究内容。