宫颈癌患者外周血黑色素瘤抗原基因-A3、基因-A6表达意义

崔春柳 董华凤 杜阳阳

河北省唐山弘慈医院(063000)

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，发病率和死亡率在全球癌症中排第四[1]。开发新的分子标记物对于宫颈癌的早期诊断，提升临床管理和改善预后具有重要意义。黑色素瘤抗原基因(MAGE)是一个高度保守的蛋白超家族，包含MAGE-A、-B和-C等多个亚家族。MAGE-A为亚家族之一，最近研究[2-4]报道其在多种恶性肿瘤中均高表达，与乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、口腔癌、肺癌和结直肠癌等恶性肿瘤的表型密切相关，已作为肿瘤的靶点被广泛研究。MAGE-A3、-A6具有高度同源性，研究发现在各种类型肿瘤中过度表达，具有促癌功能，影响肿瘤细胞增殖、转移[5-7]。上述研究表明MAGE-A3、-A6在癌症临床诊治中具有重要作用，然而，外周血MAGE-A3、-A6的表达与宫颈癌临床参数关联性尚不清楚。本研究通过检测宫颈癌患者血MAGE-A3和MAGE-A6 mRNA表达水平，探讨二者与宫颈癌发生发展可能关系，为宫颈癌临床治疗靶点的研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

本研究经过院伦理委员会批准后进行。研究对象选自2015年6月—2016年6月本院妇科诊治的宫颈癌患者(观察组)85例，年龄(45.5±9.6)岁(32～70岁)，≥45岁46例，<45岁39例，均经病理诊断确诊为宫颈癌，排除合并急性或慢性疾病患者和正在接受其他治疗的患者。对照组来源于同期本院体检、年龄相匹配的健康志愿者共85例，年龄(47.5±12.0)岁(35～70岁)，≥45岁50例，<45岁35例。纳入对象及家属签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1外周血单核细胞分离与保存使用加入肝素溶液的采血管收集研究对象晨空腹静脉血离心去上层血浆，收集沉淀细胞，加入2 ml红细胞裂解液，震荡混匀后将红细胞裂解液加至14 ml，4℃静置5 min，离心去上清，收集沉淀细胞，重复裂解3次获得单个核细胞。一部分用于检测临床指标，余-80℃保存备用。

1.2.2细胞总RNA提取和cDNA合成采用Trizol试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司)提取细胞总RNA，核酸蛋白仪(NanoDrop One/OneC，赛默飞世尔科技有限公司)检测RNA质量(OD260/280值1.8～2.0为合格)。取检测合格的RNA模板0.5～1 μg采用Power SYBRTMGreen PCR Master Mix反转录试剂盒(上海朗智生物科技有限公司)进行反转录反应合成cDNA。

1.2.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血MAGE-A3和MAGE-A6表达水平根据NCBI数据库信息，利用Primer5.0软件设计MAGE-A3和MAGE-A6的定量引物，以β-actin作为内参基因，序列见表1。引物干粉由上海生工生物工程股份有限公司生产。以cDNA为模板，参照SYBR Premix ExTaq II试剂盒(日本TAKARA公司)说明书操作，分别加入SYBR Premix ExTaq mix 10 μl，cDNA模板1 μl，上下游引物(10 μM)各1 μl，dd H2O水7 μl，混匀后应用ABI7500型实时荧光定量系统(美国ABI生物公司)对MAGE-A3和MAGE-A6的表达水平进行qRT-PCR定量检测。反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。所获得数据采用2-ΔΔCt法分析相对表达水平，每组重复3次取平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 术后随访

所有患者从确诊之日起随访5年，最晚截止到2021年6月。主要通过门诊定期复查、电话问诊、短信随访等方式，记录生存状态并计算生存率。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 血MAGE-A3和MAGE-A6 mRNA表达水平

qRT-PCR结果显示，观察组血MAGE-A3(1.63±0.34)、MAGE-A6 mRNA(1.79±0.52)相对表达水平均高于对照组(1.00±0.00、1.00±0.00)(t=17.683、14.007，均P=0.000)。

2.2 宫颈癌患者血MAGE-A3、MAGE-A6 mRNA水平与临床指标关系

按照MAGE-A3、MAGE-A6 mRNA表达水平的中位数将85例宫颈癌患者划分为高表达组和低表达组，分析两者表达与临床参数关系。结果显示，MAGE-A3 mRNA表达水平与患者临床病理学分级和淋巴结转移有关(P<0.05)，与年龄、绝经状态和病理类型无关(P>0.05)；MAGE-A6 mRNA表达水平与患者淋巴结转移有关(P<0.05)，与年龄、绝经状态、病理类型及病理学分级无关(P>0.05)。见表2。

表2 宫颈癌患者血MAGE-A3、MAGE-A6 mRNA水平与临床指标关系[例(%)]

2.3 宫颈癌患者血MAGE-A3、MAGE-A6 mRNA水平与预后

5年随访结果显示，85例宫颈癌患者中生存47例，死亡38例，总生存率为55.3%。MAGE-A3高表达组生存18例，死亡25例，生存率为41.9%；低表达组生存29例，死亡13例，生存率为69.1%。MAGE-A6高表达组生存19例，死亡24例，生存率为44.2%；低表达组生存28例，死亡14例，生存率为66.7%。Kaplan-Meier生存分析显示，MAGE-A3、MAGE-A6高表达患者5年生存率高于低表达患者(χ2=7.091，P=0.008；χ2=6.016，P=0.014)。

3 讨论

随着早期筛查和治疗方法的不断改善，宫颈癌5年生存率有所提高，但由于其易转移和复发达不到最终治愈效果，有必要从分子角度开发新的治疗靶点，为临床治疗提供指导[1]。

MAGE最初被确定为黑色素瘤抗原，在各种恶性肿瘤中均有不同程度表达。MAGE-A是MAGE的重要亚家族成员之一，对细胞凋亡和增殖具有抑制作用，其家族的一些成员已被认为是肿瘤的诊断标志物，并广泛应用于癌症的临床诊治中[8]。MAGE-A3作为MAGE-A亚家族成员之一，在许多癌症类型中被发现高表达，可作为临床诊治靶点。周高峰等[9]研究发现，MAGE-A3在膀胱癌组织和细胞中表达增强，与临床分期、分级和无进展生存期有关；聂影[10]研究认为，MAGE-A3在肝癌患者外周血表达阳性率高于正常人群，且与肝癌的早期转移密切相关。Gao等[11]和石若冰等[12]研究发现，MAGE-A3在宫颈癌组织和细胞中具有致癌活性，过表达可促进细胞增殖并抑制细胞凋亡以及增加体外肿瘤生长。结合以上研究结果，本研究检测结果显示，宫颈癌患者MAGE-A3 mRNA表达上调，表明外周血MAGE-A3在宫颈癌中有一定致癌作用；MAGE-A3表达与宫颈癌患者临床指标分析显示，MAGE-A3表达与宫颈癌患者病理学分级和淋巴结转移有关，表明MAGE-A3与宫颈癌进展存在一定关联，提示MAGE-A3可能成为宫颈癌临床治疗的靶点。

MAGE-A6与MAGE-A3高度同源，近年来常被报道与肿瘤的发生关系密切。Endo等[13]表明，MAGE-A6 mRNA在胃癌组织中表达水平增高，可能促进癌细胞远处转移；Hao等[14]分析了MAGE-A6基因转录水平的变化，表明随着食管上皮细胞发生恶性转化，MAGE-A6的转录水平迅速升高；谷丽娜等[15]研究也显示，食管癌患者血MAGE-A6 mRNA表达上升，且与食管癌临床分期、淋巴结转移和远处转移有关。本研究中宫颈癌患者血MAGE-A6 mRNA表达上调，表明MAGE-A6异常表达与宫颈癌的发生存在关联。进一步分析显示，宫颈癌患者MAGE-A6的表达与其淋巴结转移有关，表明血MAGE-A6可能在宫颈癌病情发展中发挥作用。提示临床，血MAGE-A6 mRNA检测可能对宫颈癌的早期诊断和临床治疗靶点的研究具有重要意义。

尽管宫颈癌患者的治疗方法和手段有很多，但大量随访结果仍表明预后较差，具有复发和转移的风险[16]。以往研究已表明，MAGE-A基因的高表达与肺癌、胃肠道癌、乳腺癌和卵巢癌的不良预后显著相关，可能作为预后标志物[4]。本研究利用Kaplan-Meier生存曲线对MAGE-A3、MAGE-A6的mRNA表达水平与宫颈癌患者预后关系进行了分析，结果显示，与MAGE-A3和MAGE-A6低表达患者相比，高表达患者治疗5年的生存率降低，说明血MAGE-A3、MAGE-A6高表达与宫颈癌患者的不良预后有关，可能作为宫颈癌的预后指标。

综上所述，宫颈癌患者外周血MAGE-A3、MAGE-A6 mRNA表达水平异常升高，且与宫颈癌的发生发展密切相关，且两者高表达与患者不良预后有关，提示临床可能成为宫颈癌重要的预后指标。本文存在样本量较少的不足，结果仍需进一步验证。