儿茶乙酸乙酯萃取物治疗大鼠变应性鼻炎的病理形态学研究

金建波，卢浙文，吕建森，俞余，沈雅君

变应性鼻炎（AR）是一种以免疫球蛋白E（IgE）为基础的慢性鼻咽炎症[1]，好发于儿童和青少年，全世界发病率呈持续增长趋势[2]。目前治疗AR的传统抗过敏药物仅能起到暂时缓解症状的作用，停药后易复发，甚至可能会引起不同程度的不良反应，如长期倍他米松滴鼻易引起库欣综合征，抗组胺药易引起中枢神经反应如嗜睡，白三烯调节剂可能对情绪有害，且与自杀有关等。中药儿茶学名孩儿茶，为豆科植物落叶小乔木儿茶的枝干煎汁浓缩而成的干燥浸膏，具有强大的抗炎作用[3]。关于儿茶治疗鼻炎早在《本草权度》中就有详细记载：鼻渊流水：孩儿茶末，吹之，良。现代学者应用儿茶粉与凡士林混合外用治疗慢性鼻炎的，有效率达94%[4]。然而，中药儿茶治疗AR的具体药理作用机制却知之甚少，在一定程度上限制其在临床上的使用和推广。因此，本文拟建立AR模型，观察儿茶乙酸乙酯萃取物对AR大鼠后鼻黏膜嗜酸性粒细胞、肥大细胞和血管通透性的病理形态学影响。报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料SPF级SD大鼠[浙江省维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0001]20只，体质量142～160 g。饲养环境：恒温，温度（22±2）℃，湿度50%～60%，光照每12小时明暗交替。按随机数字法分为实验组和模型组。

1.2 实验仪器和试剂

1.2.1 实验仪器酶标仪（CMaxPlus，MD，美国）、低温高速离心机（Micro 17R，Thermo，美国）、超声波清洗机（SB-5200D，宁波新芝生物科技股份有限公司，中国）。

1.2.2 实验试剂儿茶（云南，宁波济康药业有限公司），卵白蛋白（ovalbumin，OVA）、氢氧化铝（sigma，美国），伊文思蓝（Evans blue，EB）[生工生物工程（上海）股份有限公司，上海]，甲酰胺、变色酸2R（国药集团化学试剂有限公司，中国），苏木素溶液、伊红（醇溶）（北京索莱宝科技有限公司，北京），甲苯胺蓝（上海麦克林生化科技有限公司，上海）。

1.3 儿茶提取儿茶药材经本院中药房中药师鉴定为豆科植物儿茶Acacia catechu（L.f.）Willd的去皮枝干所得的干燥煎膏，用80%乙醇超声提取，重复3次，每次30 min，乙醇提取液减压浓缩得儿茶浸膏，然后用适量水混悬，依次用3倍体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取6次，留乙酸乙酯萃取液部分，真空干燥至恒重，得儿茶乙酸乙酯萃取物粗品粉末，用于AR治疗。给药前，加纯化水配制成浓度为10 mg/ml。

1.4 AR建模[5]及给药（1）基础致敏：用30 mg OVA作抗原，氢氧化铝粉末3 g作佐剂，加0.9%氯化钠注射液100 ml制成混悬液，每只大鼠腹腔注射1 ml，隔天1次，共7次。（2）鼻激发试验：配制2%OVA 0.9%氯化钠注射液，滴入双侧鼻腔，每侧0.05 ml，1次/d，共7次。造模成功后，给予1 g/L OVA滴鼻以维持对鼻黏膜的刺激，每侧鼻腔0.05 ml，隔天1次，共10次。本模型持续42 d。模型制作成功标准[6]：（1）喷嚏，一次连续3～9个为1分，10～14个为2分，≥15个为3分。（2）鼻痒，搔鼻2～3次为1分，3～5次为2分，5次以上为3分。（3）流涕，流至鼻孔为1分，超过前鼻孔为2分，流涕满面为3分。记录结果以叠加法计总分，总分（a+b+c）≥5分表示AR动物模型建立成功。观察时间为每次给药后10 min内，计算各组给药后AR症状评分。造模成功后，实验组给予儿茶乙酸乙酯萃取物灌胃100 mg·kg1·次1，2次/d，连续给药14 d。模型组不作任何处理，自由生长。

1.5 组织取材大鼠于末次给药后，颈椎脱臼迅速处死后断头并剥除上颌骨骨部皮肤，将上颌骨从颅骨中游离，取鼻中隔黏膜组织，置于4%多聚甲醛溶液中，固定24 h，常规脱水，石蜡包埋。于石蜡切片机上，做连续切片，片厚4 m，隔4张取一片，用于HE、甲苯胺蓝和Chromotrope 2R染色。

1.6 EB法检测鼻黏膜血管通透性各组大鼠于末次给药后2 h通过尾静脉注射2%的EB溶液（0.5ml/kg），经血液循环后可见眼周、鼻唇、四肢、睾丸等浅表皮肤呈蓝色。予以10%水合氯醛（0.4ml/100g）行腹腔注射麻醉，置于平板上仰卧固定。开胸暴露大鼠心脏，切开左心室，从左心室插管到主动脉并固定导管，右心房切开引流，用0.9%氯化钠注射液灌注冲洗血管中的EB，直至右心房无血液流出。用脊髓脱臼法迅速处死，剥除上颌骨骨部皮肤，将上颌骨从颅骨中游离出来，取鼻中隔黏膜组织，0.9%氯化钠注射液轻轻漂洗，滤纸吸干，准确称重50 mg置于3 ml甲酰胺中，于37℃恒温水温箱中孵育24 h，然后以3 000 r/min离心10 min。取蓝染液200 l，置于酶标仪620 nm波长处进行比色，测出EB的浓度。根据标准曲线计算得到EB浓度，并计算单位重量鼻黏膜中所含的EB的量。血管通透性以EB漏出量表示。

1.7 HE染色利用Harris氏HE染色法进行组织染色，显微镜下观察各组鼻黏膜组织病理改变。

1.8 甲苯胺蓝染色法检测鼻黏膜肥大细胞数切片置于甲苯胺蓝溶液30min，水稍洗，置于1%冰醋酸溶液中分化，直至细胞核和颗粒清晰，水稍洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。于光镜下观察肥大细胞浸润情况。采用ImageJ图像分析系统对鼻中隔黏膜肥大细胞进行计数，每组随机取5个切片，光镜下观察3个高倍视野（×400），计算均值。

1.9 Chromotrope 2R染色法检测嗜酸性粒细胞数切片放入Chromotrope 2R溶液中，浸染10 min，水稍洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光镜下观察嗜酸性粒细胞浸润情况。采用ImageJ图像分析系统对鼻中隔黏膜嗜酸性粒细胞进行计数，每组随机取5个切片，光镜下观察3个高倍视野（×400），计算均值。

1.1 0统计分析采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析，采用SNK检验；若符合正态分布但方差不齐，则采用Dunnett’s T3检验或独立样本t检验；若不符合正态分布，则采用Kruskal-WallisH检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学评价经OVA诱导后，所有大鼠均出现抓鼻、喷嚏、流涕等过敏症状，评分全部超过5分，提示造模成功。实验组AR大鼠行为学评分随时间延长逐渐下降（P＜0.05）。模型组随时间的延长，行为学评分未见明显下降（P＞0.05）。经儿茶乙酸乙酯萃取物口服治疗后的AR大鼠行为学评分在各个时间点要小于模型组，至治疗7 d后，行为学评分差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.2 鼻黏膜血管通透性情况实验组EB含量明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3 组织病理形态学观察

2.3.1 HE染色模型组鼻黏膜可见大量上皮破坏、嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润以及杯状细胞增生明显。实验组可见散在嗜酸性粒细胞、肥大细胞和杯状细胞分布，上皮破坏减少，见封三彩图4。

2.3.2 甲苯胺蓝染色肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，模型组可见大量的肥大细胞浸润。与模型组比较，实验组肥大细胞阳性数明显减少（P＜0.05），见表3。

2.3.3 Chromotrope 2R染色鼻黏膜组织中嗜酸性粒细胞的胞质呈粉红色，其他细胞不着色。模型组大鼠鼻黏膜组织中可见嗜酸性粒细胞增多，绝大多数嗜酸性粒细胞成堆分布，细胞呈圆形，胞质内充满粗大、整齐、均匀、其细胞质内可见紫红色颗粒样物质。与模型组比较，实验组大鼠嗜酸性粒细胞粒细胞显著减少（P＜0.05），见表3。

表1 各组大鼠行为学评分 分

表2 两组大鼠鼻黏膜EB含量变化g/g

表3 各组大鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞和肥大细胞计数 个

3 讨论

既往研究认为肥大细胞是AR的重要效应细胞，在AR速发相和迟发相反应中具有重要价值[7]。当AR动物吸入变应原时，肥大细胞表面的IgE与抗原分子交联活化肥大细胞，并诱导肥大细胞脱颗粒分泌大量组胺等贮存在肥大细胞颗粒物中的炎性介质，引起速发相反应，降低AR动物鼻黏膜上皮屏障的完整性，维持上皮屏障的渗漏[8]，使毛细血管通透性增加、腺体分泌增多等病理变化[9]，诱导出现AR的鼻反应，包括打喷嚏、瘙痒和鼻漏[10]。在参与迟发相反应的过程中，肥大细胞募集和活化嗜酸粒细胞等免疫细胞，导致炎性介质的进一步释放，炎性反应持续和加重，鼻黏膜出现明显组织水肿导致鼻塞。本研究结果显示OVA激发诱导AR后，肥大细胞浸润脱颗粒明显，血管通透性增加，伴随而来的AR大鼠喷嚏、抓鼻等鼻部行为学评分明显增加，经儿茶乙酸乙酯萃取物处理后，肥大细胞浸润减少，脱颗粒水平显著抑制，并下调了血管通透性水平，使鼻过敏行为学症状明显减轻，尤其是鼻摩擦。

嗜酸性粒细胞局部浸润是AR重要病理学特征之一[11]，其浸润程度与鼻部症状评分显著相关[12]。本研究模型组大鼠光镜下可见鼻黏膜嗜酸性粒细胞出现特征性的大量浸润，鼻黏膜血管通透性增加，鼻部行为学评分显著升高，与文献[13]报道一致。AR大鼠经儿茶乙酸乙酯萃取物干预处理后，HE染色结果和嗜酸性粒细胞染色结果均显出鼻黏膜嗜酸性粒细胞局部浸润和脱颗粒现象明显减少，血管通透性降低，AR大鼠鼻部行为学特征显著改善，这表明儿茶乙酸乙酯萃取物可能通过减少嗜酸性粒细胞局部浸润来改善AR鼻部症状。

综上所述，儿茶乙酸乙酯萃取物对AR大鼠具有一定的治疗作用，可能通过抑制肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润，降低肥大细胞和嗜酸性粒细胞脱颗粒，抑制活化而发挥作用，为临床中药儿茶治疗鼻炎提供了一定的实验依据。中药儿茶的主要活性成分儿茶素和表儿茶素[14]，儿茶乙酸乙酯萃取物治疗AR的活性物质可能与儿茶素类化合有相关[15]，但其相关性研究仍需进一步深入。