维生素D3对紫杉醇诱发大鼠周围神经病理性疼痛的影响

吴春娴，高彬，王亮，张瑞，孙建良

肿瘤化疗药物诱导的周围神经病理性疼痛是化疗药物最常见的不良反应之一，总体发生率可高达38%～87%。紫杉醇（PTX）等化疗药物诱发的周围神经病变（CIPN）主要表现为手足疼痛、麻木或痛觉超敏等症状，严重影响患者生活质量和化疗疗程的完成[1]。目前临床常用的治疗药物，如离子通道阻滞剂、抗炎药、三环类抗抑郁药和抗惊厥药物，均不能达到临床预期的治疗目标，且常伴有严重的毒副作用。研究表明，维生素D在治疗神经病理性疼痛中发挥良好作用，在已建立的多种大鼠CIPN模型中，如坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）导致的神经性疼痛模型和糖尿病周围神经性疼痛模型等，都证实补充维生素D可减轻大鼠神经病理性疼痛的超敏反应，这可能与维生素D抑制炎症和氧化应激有关[2]。本研究拟探讨维生素D3对PTX诱发的大鼠周围神经病理性疼痛的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及分组健康SD雄性大鼠35只（维通利华实验动物技术有限公司提供），6周龄，体质量200～220 g，于宁波大学实验动物中心（SPF级）适应3～5 d；大鼠饲养环境：室温20～25℃，湿度60%，自由摄食和饮水，光照与黑暗时间均为12 h。将大鼠按随机数字表法分为5组（n=7）：对照组（Con组）、PTX溶剂组（PTX Vehicle组)、PTX组、PTX+维生素D3溶剂组（PTX+VitD3Vehicle组）和PTX+维生素D3组（PTX+VitD3组)。

1.2 主要试剂和仪器PTX（阿拉丁公司，批号：D2123072，规格：250mg/瓶）；聚氧乙烯蓖麻油（阿拉丁公司，批号：I1805053，规格：250g/瓶）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20210820，规格：500 ml/瓶）；维生素D3（阿拉丁公司，批号：J2112208，规格：1g/瓶）；Von Frey纤维丝（美国Danmicglobal公司，型号：Aesthesio）；多功能微型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge 5430R）；智能冷热痛觉测试仪（法国BIOSEB公司，型号：BIO-CHP）；ELISA试剂盒（上海泛柯实业有限公司，批号：202111）。

1.3 实验动物建模及给药将PTX溶于PTX溶剂（聚氧乙烯蓖麻油∶无水乙醇=1∶1，6 mg/ml），再用0.9%氯化钠注射液稀释至2 mg/ml。PTX组、PTX+VitD3组和PTX+Vit D3Vehicle组大鼠隔日腹腔内注射PTX 2 mg/kg，共4次（1、3、5及7 d）达到累积剂量8 mg/kg，建立CIPN模型。Con组和PTX Vehicle组于相同时间点腹腔注射等容量的0.9%氯化钠注射液和PTX溶剂（聚氧乙烯蓖麻油∶无水乙醇∶0.9%氯化钠注射液=1∶1∶4，1 ml/kg）。将维生素D3溶于无水乙醇（1g/l=40 U/l），再用0.9%氯化钠注射液稀释25倍至1.6 U/l。PTX+VitD3组和PTX+VitD3Vehicle组从1、3…19 d隔日腹腔注射维生素D3（2 000 U/kg）和维生素D3溶剂（0.1%乙醇1.25ml/kg），共10次。

1.4 观察指标

1.4.1 一般情况实验期间每天观察大鼠的运动、进食、饮水量、排便、排尿及脱毛等情况，并记录有无扭体、抽搐等异常行为。于给药前（d0）和给药后1、3…19、20 d隔天记录大鼠的体质量。

1.4.2 行为学测定所有大鼠分别于d0和给药后4、8、12、16及20 d，用Von Frey纤维细丝测定50%右足底机械缩足反应阈值（50%PWTs），用冷热板测痛仪测定热缩足潜伏期（TWL）。

1.4.3 50%PWTs测定将大鼠置于底部为金属筛网（1 cm×1cm）的透明有机玻璃箱（22cm×22 cm×22cm）中，玻璃箱被架高于实验台面50 cm。金属网上盖以透明的有机玻璃罩，先让大鼠适应环境20 min左右,待大鼠的梳理和探究活动基本消失后，从2.0 g力度开始按照“Up&Down”法刺激大鼠后足掌底中部（避开突起部位），纤维丝需弯曲至“C”或“S”型并维持6～8 s，观察大鼠是否出现缩足反应并记录[3]。大鼠在刺激时间内或在移开Von Frey纤维时立即出现快速的抬足或舔足反应，记为阳性反应“X”，而大鼠无反应或身体活动所引起的缩足反应记作阴性反应“O”。阴性反应时，予大一级力度纤维丝进行刺激，阳性反应时则改用小一级的纤维丝进行刺激，如此连续进行直至出现第1次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4次，得到一串以“O”或“X”组合的序列，将该序列与最后一根纤维丝编号（xf）代入公式50%PWTs（g）=10（xf+k）/1 000计算，为各根纤维丝取对数后的均差，约等于0.224。若计算得出的50%PWTs＞15.0 g或＜2.0 g，则仍以15.0 g或2.0 g作为最大或最小值，每次刺激之间间隔30 s。

1.4.4 热缩足潜伏期（TWL）测定先让大鼠适应环境20 min，待大鼠能较好的适应当前环境后,将大鼠放在表面温度（52.0±0.1）℃的智能冷热板测痛仪上，上面罩以透明塑料笼，当大鼠出现快速缩足、舔趾或撕叫任一反应时即踩下热板仪的踏板，记录热板仪显示屏上的时间即为TWL[4]。为避免大鼠出现组织损伤，设定热板自动切断时间为15s。每只大鼠测定3次，每次间隔15min，取3次平均值为大鼠TWL值。

1.4.5 大鼠血清25（OH）D3测定采大鼠眼眶血，分离血清，按照酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒说明书进行操作，全自动生化分析仪检测大鼠血清25-（OH）D3水平，每个实验都包含了标准曲线，每个样本检测2次，取平均值。

1.5 统计方法数据采用Prism 9.0（Graphpad,La Jolla，CA）软件分析，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用F检验，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况实验期间5组大鼠均未出现脱毛、腹泻及运动失常等情况，毛色光滑柔软，活动情况自如，体质量均缓慢增长。5组大鼠体质量在d0及给药后1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及20d时差异均无统计学意义（F≤13.21，均P＞0.05），见封二彩图3。

2.2 50%PWTs变化比较5组大鼠在d0时50%PWTs差异无统计学意义（F=197.7，P＞0.05）。PTX组和PTX+VitD3组大鼠50%PWTs在4、8、12、16及20 d时明显低于Con组（t≥6.18，均P＜0.05）。PTX+VitD3组大鼠50%PWTs在8、12、16及20 d时明显高于PTX组（t≥2.32，均P＜0.05），见封二彩图4。

2.3 TWL变化比较5组大鼠TWL在d0时差异无统计学意义（F=151.2，P＞0.05）。PTX组大鼠TWL在4、8、12、16及20 d时明显低于Con组（t≥6.46，均P＜0.05）。而PTX+VitD3组大鼠TWL在12、16及20 d时明显低于Con组（t≥5.33，均P＜0.05）。PTX+VitD3组大鼠TWL在4、8、12、16及20 d时明显高于PTX组（t≥4.21，均P＜0.05），见封三彩图1。

2.4 血清25-（OH）D3的变化 5组大鼠血清25-（OH）D3在d0时差异无统计学意义（F=22.97，P＞0.05）。PTX组大鼠血清25-（OH）D3在12及20 d时明显低于Con组（t≥2.63，均P＜0.05）。PTX+VitD3组大鼠 在20 d时明显高于Con组（t=5.13，均P＜0.05）。PTX+Vit D3组大鼠血清25-（OH）D3在12及20 d时明显高于PTX组（t≥5.01，均P＜0.05），见封三彩图2。

3 讨论

本研究参照文献介绍的方法[5]，隔日腹腔注射PTX 2 mg/kg，共4次，观察到模型组大鼠50%PWTs和TWL值均有显著降低，且最低值出现在给药后1周左右，这与之前研究结果一致[5]，表明PTX诱发的CIPN模型大鼠制备成功。

多个临床实验证实，补充维生素D可缓解多种类型的慢性疼痛，如偏头痛、腰背痛、癌痛和骨性疼痛等[6]。动物研究也有报道维生素D3对完全弗氏佐剂（CFA）导致的慢性膝关节炎疼痛模型大鼠有镇痛作用[7]。本研究针对PTX诱导的大鼠CIPN模型，发现反复腹腔注射维生素D3后，干预组较模型组大鼠50%PWTs在8 d开始有显著升高，TWL在4 d时出现显著升高并持续至20 d，但较对照组仍有明显降低，提示腹腔注射维生素D3能够在一定程度上缓解PTX诱发的大鼠机械和热痛敏。

基于已有证据，推测维生素D3改善大鼠痛觉过敏的可能机制有：（1）维生素D在星形胶质细胞信号途径中起着重要作用，从而发挥了神经保护作用[8]。（2）维生素D作为一种神经活性类固醇，可以调节神经元的兴奋性。在一定程度上，这种免疫调节作用可以减轻疼痛症状[2]。（3）维生素D的镇痛作用更有可能是由于其抗炎作用，而不是抗伤害作用。维生素D似乎是通过减少促炎细胞因子的释放和抑制T细胞反应来发挥其抗炎作用[8]。此外，维生素D还可以调节脊髓中的促氧化剂和抗氧化标志物[9]。

维生素D3在体内的主要活性形式为25-（OH）D3和1，25-（OH）2D3两种，其中25-（OH）D3为主要循环形式，且25-（OH）D3半衰期较1，25-（OH）2D3长，可以在血中维持比较恒定的浓度，通常用它来评估体内的活性维生素D3状态较为准确。本实验结果表明，腹腔注射PTX后，模型组大鼠的血清25-（OH）D3出现持续下降趋势，表现为维生素D不足。维生素D3干预组的大鼠血清25-（OH）D3水平未见明显降低，且在20d时较对照组有显著升高（但仍在正常范围内），表明隔日腹腔注射维生素D3（2000U/kg）是安全可靠的。但干预组大鼠的痛敏阈值在实验期间仍较对照组显著降低，表明血清25-（OH）D3水平与大鼠痛觉过敏之间无明显关系。

维生素D3价格便宜，不良反应相对较少，即使出现通常也是轻微的。在作者实验中也没有观察到大鼠体质量减轻和异常表现等毒性反应的现象。以往的临床研究表明，人体摄入过量的维生素D（每天超过50000U）导致高钙血症的很少，每天服用10000U的维生素D3持续5个月，也没有发现毒性反应[7]。且绝大多数患者并没有使用维生素D3的禁忌证，因此维生素D3可能是一种安全、简单和潜在有益的治疗神经病理性疼痛患者的药物。虽然有一定程度的证据表明，补充维生素D对治疗慢性疼痛是有效的，但由于缺乏足够的随机和安慰剂对照临床研究，目前的证据还不能证明补充维生素D3是对慢性疼痛有效的独立治疗方法。

综上所述，腹腔注射维生素D3能够在一定程度上缓解PTX诱发的大鼠周围神经病理性疼痛，为临床化疗痛的防治提供了新的探索方向。