远华蟾蜍精抑制人肝癌Huh7细胞增殖及诱导细胞死亡

李明勇 胡莹莹 吴嫦丽 林春燕 梁洪英 李 蓉

广东医科大学1.病理生理教研室；2.生理学教研室；3.生理科学实验室，广东湛江 524023

肝细胞癌（hepatic cell carcinoma，HCC）是全球最为常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和病死率［1］，病因复杂，发病机制尚未完全清楚。目前，临床上常见的治疗方案有手术切除、肝移植和放疗等，但多数HCC被确诊时已为晚期，5年预后不甚理想［2］。因此，研究和开发新型的抗HCC药物以提高治疗效果和延长患者生存期是HCC 临床治疗急需解决的关键问题，而寻找副作用较小的天然药物具有重要意义。

远华蟾蜍精（telocinobufagin，TBG），分子式为C24H34O5，相对分子质量为402.52，是从中华大蟾蜍蟾酥中提取纯化的单体化学活性成分之一，具有强心、抗炎等多种药理学作用［3-4］。研究表明，TBG 能显著抑制非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌等癌细胞的增殖和转移［5-7］。目前尚未有TBG 对HCC 影响的报道。本实验旨在分析TBG 对HCC 细胞增殖和死亡的影响，并对其可能的分子机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1 实验细胞株和主要试剂

肝癌Huh7 细胞株购自武汉普诺赛公司，由广东医科大学生理科学实验室保存，使用含10%胎牛血清的培养基，在37 ℃，5%CO2培养箱里培养，选择状态良好的细胞用于实验。高糖DMEM 细胞培养基、胰酶、胎牛血清（biological industries，BI）、BCA蛋白测定试剂盒（碧云天公司），Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司），细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒（碧云天公司），PARP、Cleavedcaspase-3、caspase-4 一 抗（美 国CST 公 司），GSDMDC1（Santa Cruz 公司），Bax、Bcl-2 一抗（碧云天公司），流式细胞仪购于美国BD 公司，低温高速离心机购自德国Eppendorf公司，细胞培养超净工作台购于上海力申科学仪器公司，细胞培养板购于美国Corning公司。

1.2 CCK-8检测TBG对肝癌细胞增殖的影响

将细胞（大约104个细胞/孔）接种在96孔板中，贴壁，过夜，更换含不同浓度药物的培养基［TBG浓度分别为0（空白对照组）、25、50、100、200、400 nmol/L］继续培养48 h和72 h。然后，在每个孔中加入10 μL CCK-8溶液和100 μL培养基。在37 ℃下培养2 h后，使用微孔板读取器检测450 nm 处的光密度。根据浓度曲线计算IC50值。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡和焦亡

将Huh-7 细胞培养至70%～80%汇合，用不同浓度的TBG［0（空白对照组）、25、50、100、200、400 nmol/L］处理48 h，收集细胞。然后根据制造商的方案用FITC-Annexin V 凋亡检测试剂盒Ⅰ处理细胞，并立即收集样品，通过流式细胞仪进行分析。

1.4 免疫荧光检测细胞凋亡和焦亡

将肝癌细胞以2×105个细胞/孔接种于24孔板中。细胞在含有10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基，37 ℃、5%CO2的增湿空气中培养24 h，然后用不同浓度药物［TBG浓度分别为0（空白对照组）、25、50、100、200、400 nmol/L］处理。处理48 h 后，按细胞凋亡-Hoechst 检测试剂盒说明书进行操作：加入0.5 mL 固定液，固定10 min；用PBS 洗2 遍，每次3 min；加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色10 min。用荧光显微镜拍照分析。

1.5 Western-blot检测细胞凋亡和焦亡相关蛋白

细胞经不同浓度药物处理后，用含有1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA 裂解缓冲液进行裂解，离心后收集上清，BCA 法检测蛋白浓度。取50 μg蛋白质在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳；使用Bio-Rad湿转仪器将凝胶中分离的蛋白质转移到0.22 μm聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。用5%BSA室温封闭1 h，一级抗体4 ℃孵育过夜。洗涤后，膜与抗兔/抗鼠二级抗体室温孵育1 h，使用ECL 化学发光源显影。

1.6 统计学方法

采用Prism 5 统计软件进行数据分析。计量资料采用xˉ±s表示。两组数据比较采用独立样本t检验，多个样本之间的比较采用方差分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 TBG抑制肝癌Huh7细胞的增殖

分别用25、50、100、200、400 nmol/L TBG 处理细胞48 h和72 h，TBG以浓度及时间依赖方式抑制肝癌Huh7细胞的增殖（表1，图1）。TBG抑制肝癌Huh7细胞增殖48 h 和72 h 的IC50值分别为482.7 nmol/L和221.1 nmol/L。

表1 不同浓度TBG对肝癌Huh7细胞存活率的影响（%，n=6）

图1 不同浓度TBG对肝癌Huh7细胞存活率的影响

2.2 TBG诱导肝癌Huh7细胞凋亡和焦亡

流式细胞仪帮助判断细胞是否发生焦亡。细胞发生焦亡时，细胞膜的通透性增加，碘化丙啶（propidium iodide，PI）可以自由进入细胞将DNA着色，而细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）可以被FITC 标记的抗体（Annexin Ⅴ）所标记。细胞发生凋亡时，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧，从而被其抗体着色。用流式细胞仪来区分细胞发生凋亡还是焦亡时，细胞凋亡只能显示Annexin Ⅴ单阳性（Q4 区细胞数）；而细胞焦亡则会发生PI 和Annexin Ⅴ的双阳性（Q2 区细胞数）。

Annexin Ⅴ-PI 双染的流式细胞分析结果表明，随着TBG 浓度的增加，肝癌Huh7 细胞的凋亡率逐步上升。100、200、400 nmol/L TBG 引起的肝癌Huh7细胞Q4区细胞比例分别是（11.23±2.36）%、（14.43±1.98）%、（15.60±2.49）%，各组凋亡率差异具有统计学意义（F=17.45，P＜0.001）；而Q2 区细 胞 比 例 分 别 是（33.97 ± 6.43）%、（40.37 ±7.90）%、（45.87±2.79）%，各组焦亡率差异具有统计学意义（F=16.67，P＜0.001）（图2，图3），表明TBG 主要通过焦亡，其次为凋亡的方式诱导Huh7细胞死亡。Hoechst 33258 染色显示，TBG 诱导Huh7细胞呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染的细胞核固缩现象，即形成典型的凋亡小体（图4）。结合流式细胞仪分析和免疫荧光结果，表明TBG能以剂量依赖的方式诱导肝癌Huh7 细胞发生凋亡和焦亡。

图2 TBG作用肝癌Huh7细胞48 h后流式细胞术分析结果

2.3 Western blot检测细胞凋亡和焦亡相关蛋白表达量变化

应用蛋白免疫印迹检查细胞焦亡和细胞凋亡相关蛋白表达结果显示，TBG 引起肝癌Huh7 细胞中caspase 4 和GSDMDC1 表达显著升高，caspase 3和PARP蛋白出现片段化，Bcl2表达降低（图5）。上述结果说明：TBG 能够诱导caspase 4 和GSDMDC1活化进而激活细胞焦亡通路；抑制Bcl2 的活化，导致caspase 3和PARP发生剪切进而激活凋亡通路。

图3 TBG作用肝癌Huh7细胞48 h后流式细胞术分析细胞凋亡率和焦亡率

图4 TBG诱导肝癌Huh7细胞凋亡（Hoechst 33258染色×100）

图5 TBG作用肝癌Huh7细胞48 h后Western blot的变化

3 讨 论

研究发现，多种中药及其活性成分可通过多种途径发挥抗HCC作用，如：高三尖杉酯碱、小檗碱等可阻滞肝癌细胞的细胞周期［8-9］；分心木乙醇提取物、冬凌草甲素等可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞的侵袭和迁移［10-11］；醌茜素、苦参碱等可诱导肝癌细胞凋亡［12-13］；柴胡皂苷、京尼平苷等通过阻断血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达抗肿瘤血管生成，最终抑制肿瘤生长和转移［14-15］。

蟾蜍在我国分布广泛，其身上提取的蟾酥是我国珍贵的中药材，内含多种生物成分，具有解毒、消肿止痛、强心利尿、抗癌等功效，其制成的各种制剂广泛应用于临床［16］。TBG作为蟾酥的提取物，也具有丰富的药理作用。

细胞死亡形式包括细胞坏死、细胞凋亡、细胞自噬以及细胞焦亡等。细胞焦亡被定义为由焦孔素（gasdermin，GSDM）介导的炎症形式的程序性细胞死亡。目前研究证实，焦亡能够抑制肿瘤细胞异常增殖，促进其死亡。人GSDM家族包括6个成员，其中GSDMD 是代表性蛋白，是焦亡的关键分子，GSDMD 介导的细胞焦亡途径包括caspase-1介导的经典焦亡途径和caspase-4/-5/-11介导的非经典焦亡途径［17］。研究发现，GSDMD 介导的细胞焦亡途径激活对肿瘤增殖、侵袭活动发挥抑制作用并能逆转肿瘤的耐药性［18］。最近研究发现，miRNA-214 可通过直接靶向caspase-1调节细胞焦亡，抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移［19］。Qiao 等［20］研究发现，在上皮性卵巢癌中，α-NETA 介导caspase-4/GSDMD 通路，诱导癌细胞焦亡，进而逆转肿瘤耐药性。

本研究CCK-8 检测结果显示，TBG 对肝癌Huh7 细胞的增殖有明显的抑制作用。随着TBG处理浓度和时间的增加，细胞活力逐渐降低；Annexin Ⅴ-PI 荧光双染流式结果提示，随着TBG浓度的增加，肝癌Huh7 细胞的凋亡率逐步上升，但肝癌Huh7 细胞Q2 区（Annexin Ⅴ/ PI 双阳性）细胞比例明显比Q4 区细胞（Annexin Ⅴ单阳性）比例高，表明TBG 可能主要通过焦亡，其次为凋亡的方式诱导肝癌Huh7 细胞死亡，从而抑制肝癌细胞的体外生长。Western blot 检查结果显示，TBG 可引起肝癌Huh7 细胞中caspase 4 和GSDMDC1 表达显著升高，caspase 3 和PARP 蛋白出现片段化，Bcl2表达降低，说明TBG 可能通过激活caspase 4/GSDMD 非经典途径诱导肝癌Huh7 细胞焦亡；通过抑制Bcl2 的活化，导致caspase 3 和PARP 发生剪切进而激活凋亡通路。

本研究显示，TBG 对肝癌Huh7 细胞具有抑制增殖、诱导细胞凋亡和焦亡的作用，提示其可作为HCC治疗的备选药物。本研究仍存在诸多不足，如未深入研究TBG 抗肿瘤的分子机制，对GSDMD 介导的促肿瘤或抗肿瘤的具体机制认识十分有限，同时也未在动物体内验证TBG的抗肿瘤疗效，有待后续实验进一步明确。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突