恩施大蒜根腐病病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性及室内药效试验

周洁，齐传东，吴金平，符家平，肖颖，郭凤领

1.湖北省农业科学院经济作物研究所，湖北 武汉 430064 2.蔬菜种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064

大蒜(AlliumsativumL.)又名胡蒜、蒜头，为百合科葱属植物，其鳞茎富含多糖、蛋白质和维生素等多种营养物质以及具独特风味的含硫化合物，具有抗菌、抗氧化、抗癌等多种功效[1]，被誉为“天然抗生素”。目前，我国是世界大蒜栽培面积最大和产量最高的国家之一[2]，是世界上的大蒜生产和消费大国，同时大蒜也是我国重要的出口创汇蔬菜[3]。随着大蒜产业的不断发展，生产上各种病害的发生也日益显现。汪甜等[4]研究发现山东大蒜主产区的根腐病致病菌主要类群为镰刀属和茎点霉属；由白腐小核菌引起的大蒜白腐病在云南大理州大蒜种植区发生较为普遍[5]；钟文文等[6]发现解淀粉芽孢杆菌可导致山东苍山大蒜贮藏期腐烂病害的发生；而茄匐柄霉则可引起湖北当阳大蒜白斑病的发生[7]。各种病害的发生严重影响了大蒜的产量和品质，制约了大蒜产业的绿色健康发展。

近年来，大蒜根腐病在我国频繁发生，导致平均每年20%～30%的减产，逐渐成为大蒜主要病害之一。现有研究表明，根腐病致病菌种类多样，腐霉、镰刀菌、细菌等均可导致大蒜根腐病的发生[8-10]。湖北恩施地区的大蒜根腐病病原菌经鉴定为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)[11]，但至今未见该致病菌生物学特性及室内药效等相关方面的报道。为此，本研究对导致大蒜(AlliumsativumL.)根腐病的尖孢镰刀菌进行生物学特性测定及室内药剂筛选，以期为进一步防控该病害提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大蒜根腐病病原菌尖孢镰刀菌GRR-1(Fusariumoxysporum)(MW660368)由蔬菜种质创新与遗传改良湖北重点实验室保存，于2021年6月取出活化。12种供试药剂采购于市场，详情见表1。

表1 供试药剂及使用浓度Table 1 Test drugs and use concentration

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌致死温度的测定

参考郭强等[12]的方法略有改动。用5mm打孔器于生长3d的病原菌菌落边缘打取菌块放置于2mL离心管中，在不同温度下水浴10min，转接于PDA平板，连续3d观察菌丝生长情况。水浴温度分别为35、40、45、50、55、60、65、70℃，每个处理重复3次。初步得到致死温度范围后以1℃温差设置温度梯度，确定菌丝致死温度。

1.2.2 pH对病原菌菌丝生长的影响

用稀盐酸和氢氧化钠将PDA培养基pH分别调至5、6、7、8、9、10和11等7个梯度，用5mm打孔器于生长3d的病原菌菌落边缘打取菌块放置于不同pH的PDA平板正中央，23℃培养箱中培养3d，利用十字交叉法测定菌落直径，测量数据减去菌块直径即为菌丝生长直径。每个处理重复3次。

1.2.3 氮源和碳源对病原菌菌丝生长的影响

参照张凯东等[13]方法略有改动。以Czapek培养基为基础培养基，以0.2%的添加量分别添加甘氨酸、酵母、蛋白胨、磷酸氢二铵、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、L-谷氨酸钠等，配制8种不同氮源培养基；以3%的添加量分别添加D-果糖、α-乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等，配制7种不同碳源培养基。用5mm打孔器于生长3d的病原菌菌落边缘打取菌块放置于不同培养基正中央，23℃的恒温培养箱中培养3d，利用十字交叉法测定菌落直径，测量数据减去菌块直径即为菌丝生长直径。每个处理重复3次。

1.2.4 杀菌剂对病原菌抑制作用的测定

利用菌丝生长速率法[14]测定供试药剂对病原菌的抑制效果。试验所用药剂及使用终浓度如表1所示。先按需配制各药剂母液，按照各药剂说明书推荐浓度以一定比例加入55℃左右的PDA培养基中，使不同含药培养基中药剂终浓度达到推荐浓度，充分混匀后倒平板，制备成不同的含药培养基。以不含药的PDA培养基为对照。用5mm打孔器于生长3d的病原菌菌落边缘打取菌块放置于不同培养基正中央，23℃的恒温培养箱中培养3d，利用十字交叉法测定菌落直径，测量数据减去菌块直径即为菌丝生长直径。每个处理重复3次。各药剂的抑菌率计算方法参考文献[14]。

1.3 数据分析

试验数据利用SPPS 16.0软件进行统计分析，利用单因素方差分析比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 病原菌的致死温度

将大蒜尖孢镰刀菌菌块在不同温度下水浴10min后，观察菌丝生长情况。当在温度达到55℃时，菌块恢复生长时间相对较长，生长速度减慢；当温度达到60℃，菌块仍可缓慢恢复生长，但后期长出的菌丝较为稀疏；当温度达到或高于65℃时，菌块死亡，无新菌丝长出，不能恢复生长。随后以60℃为起点温度，1℃为温差依次进行61、62、63、64、65℃的处理，结果显示3d后，经63℃处理的菌块菌丝已无法生长。由此可见，大蒜根腐病病原菌的致死温度为63℃。

2.2 pH对菌丝生长的影响

不同pH培养基下病原菌菌丝的生长情况如图1所示，病原菌在pH为5～9时均生长良好，其中pH为7时生长速度最快。当pH超过9时，病原菌生长随着pH的升高而显著减缓。

注： 不同小写字母表示在0.01水平差异显著，图2～3同。 图1 不同pH PDA培养基下大蒜根腐病病原菌的菌落直径 Fig.1 Colony diameter of pathogen of garlic rootrot under different pH PDA media

2.3 氮源和碳源对病原菌菌丝生长的影响

不同氮源培养基下病原菌菌丝的生长情况如图2所示，可见病原菌在8种不同氮源培养基上均能生长。其中以硝酸铵为氮源的培养基上菌丝生长最慢，菌落平均直径仅为1.42cm；以酵母和蛋白胨为氮源的培养基上菌丝生长最快，菌落平均直径均超过6cm，极显著高于其他氮源培养基。病原菌对不同氮源的利用率由高到低的顺序为蛋白胨、酵母、L-谷氨酸钠、硝酸钾、磷酸氢二铵、甘氨酸、硫酸铵、硝酸铵，其中对甘氨酸、磷酸氢二铵和硫酸铵的利用率差异不显著。

图2 不同氮源培养基下大蒜根腐病病原菌的菌落直径 图3 不同碳源培养基下大蒜根腐病病原菌的菌落直径Fig.2 Colony diameter of pathogen of garlic root rot under different nitrogen source media Fig.3 Colony diameter of pathogen of garlic root rot under different carbon source media

不同碳源培养基下病原菌菌丝的生长情况如图3所示，可见病原菌在7种不同碳源培养基上均能生长。其中以D-果糖为碳源的培养基上菌丝生长最慢，菌落平均直径仅为0.58cm；以乳糖为碳源的培养基上菌丝生长最快，菌落平均直径为2.60cm，极显著高于其他含碳培养基。病原菌对不同碳源的利用率存在一定差异，由高到低的顺序为乳糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘露醇、D-果糖，其中对葡萄糖和甘露醇的利用率差异不显著。

2.4 不同杀菌剂对病原菌的抑制作用

不同杀菌剂对大蒜根腐病病原菌的抑制效果如表2所示，稀释5000倍的75%肟菌戊唑醇水分散粒剂对病原菌菌丝生长的抑菌效果最佳，抑菌率达到81.09%；稀释1000倍的250g/L吡唑醚菌酯乳油、25%三唑酮可湿性粉剂和2亿个/g木霉菌水分散粒剂对病原菌的抑制率均超过50%；其他供试药剂对该病原菌的抑制效果较差，其中推荐浓度下的80%乙蒜素乳油、80%多菌灵可湿性粉剂、80%代森锰锌可湿性粉剂和10%多抗霉素可湿性粉剂对该病原菌的抑菌率均不到10%，防治效果较差。

表2 不同杀菌剂对大蒜根腐病病原菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of different fungicides on pathogen of garlic root rot

3 讨论与结论

大蒜作为药食同源食物之一，是餐桌菜肴中常见之物，因其具有广谱杀菌作用，被称为天然抗生素，此外还具有抗氧化、抗肿瘤、延缓衰老等多种功能，开发利用前景广阔[15]。随着大蒜产业的发展和经济效益的显著提升，大蒜种植面积日益扩大，种质退化、连作和病害的发生已严重制约了大蒜产业的健康可持续发展。

前人研究表明大蒜根腐病病原包括真菌性和细菌性病原菌，高园园等[16]研究发现山东省大蒜根腐病病原菌包括尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、芳香镰刀菌和木贼镰刀菌，其中尖孢镰刀菌为其主要致病菌。本研究中恩施大蒜根腐病经前期鉴定由尖孢镰刀菌侵染所致，通过生物学测定发现该病原菌的致死温度为63℃，最适生长pH为7.0，最佳碳源为乳糖，供试碳源中对D-果糖的利用率最低，最佳氮源为酵母和蛋白胨。而烟草根腐病致病菌尖孢镰刀菌的最适生长pH为6.0～8.0，与本研究结果相似，但最适碳氮源分别为蔗糖和硝酸钾[17]，与本研究结果存在一定差异；甘草根腐病致病菌的最适pH为7.0，最佳碳氮源分别为木糖醇和蛋白胨[18]，与本研究基本相似，仅碳源利用率存在差异。由此可见，不同寄主上的尖孢镰刀菌的生物学特征存在一定差异，可能与尖孢镰刀菌存在多种转化型有关。此外，多种作物如豇豆[19]、党参[20]和番茄[21]等的根腐病均由多种病原菌复合侵染所致，其中尖孢镰刀菌为优势致病菌，后期可多点采集湖北地区大蒜根腐病样进一步分析鉴定，以明确是否存在复合侵染的情况。此外，12种供试药剂中，75%肟菌戊唑醇对尖孢镰刀菌的室内防治效果达到81.09%，而多菌灵和代森锰锌的防治效果较差，一方面可能与田间的用药习惯有关，另一方面肟菌戊唑醇为三唑类和甲氧基丙烯酸酯类复配药剂，而多菌灵和代森锰锌分别为苯并咪唑类和硫代氨基甲酸酯类单一类型药剂，长期使用易导致病原菌抗药性的产生。因此，建议在生产上使用不同类型的复配药剂或者不同类型药剂交替使用。

本研究探讨了大蒜根腐病致病菌尖孢镰刀菌的生物学特性，并比较了12种常用药剂对该病原菌的室内防治效果，接下来可结合前人相关研究结果，对湖北地区的大蒜根腐病病原进一步分析鉴定，同时对潜力药剂进行田间防效测定，以期为大蒜根腐病的防控提供科学依据。