水稻根系性状QTL定位及候选基因表达分析

殷文晶， 陈振概， 高佩慧， 芦 涛， 叶涵斐， 叶润乐，杨 茜， 路 梅， 王跃星， 饶玉春

(1．浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2．中国水稻研究所，浙江 杭州 311121)

0 引 言

水稻(OryzasativaL.)为禾本科稻属植物，我国主要粮食作物之一[1]．根系是水稻的重要营养器官，在生长发育中发挥着重要的作用，如吸收水肥、固定植株和合成运输物质等．挖掘并分析水稻根系性状控制基因，对培育水稻理想株型中根系育种的研究,进而提高水稻粮食产量和品质问题具有重要现实性意义．

凌启宏等[2]发现，分布深且多纵向的根型可利于叶片直立化生长进而提高水稻产量，提出要着重塑造理想株型中根系这一新要求．袁隆平院士[3]则提出将“根系发达”这一属性纳入构建理想新株型的主要性状中，并高度重视水稻地下根系与地上部株型相关性的研究[4]．与此同时，魏磊等[5]研究表明，要充分发挥杂交水稻增产的潜力就需要加强根系育种的研究．迄今为止，愈来愈多的根系性状QTL区间及控制基因被挖掘，较多研究表明，水稻根系性状属于多基因控制的数量性状．

水稻的根系性状是受多种因素影响的[6]，其相关调控机制复杂．目前，在水稻根系性状中，挖掘到有关根长的QTLs大约有112个，12条染色体上均有分布．吴伟明[7]通过QTL区间定位检测发现，在第7，8，9，11和12号染色体上分布着7个与水稻总根长相关的QTLs；在第9，11和12号染色体上分布着6个与根表面积相关的QTLs；另外在第6，9，11和12号染色体上分布着5个与根平均直径相关的QTLs．根表面积是水稻根系与外界直接接触的部位，主要发挥从土壤中吸收植物生长所需养分和水分等重要功能．翟荣荣等[8]通过20%PEG溶液模拟干旱条件下的水稻根系发育情况，研究发现，在正常条件下，分别于第2，3号染色体上定位到2个与根表面积相关的QTL；在20%PEG干旱胁迫下，分别于第3，6号染色体上定位到2个与根表面积相关的QTL．研究表明，水稻根系直径中的筛管与导管越多、越大，很可能会提高根系中水、无机盐及有机物等营养物质的运输效率．翟荣荣等[8]利用PEG模拟干旱胁迫环境．在正常条件下，在第11号染色体的RM167～RM5704标记区间内定位到一个与根平均直径相关的QTL，LOD值为3.62；在干旱胁迫下，在第5号染色体的RM3800～RM3870标记区间内定位到一个与根平均直径相关的QTL，LOD值为3.38．

以上研究表明，根系性状的生长情况，对水稻的产量和品质有着直接或间接影响，通过QTL区间定位方法，前人虽已对根系性状QTL大量挖掘，但已被报道从根系QTLs成功克隆的功能基因并不多．因此，本研究通过利用籼粳交(HZ/Nekken2)构建的重组自交系群体(RILs)为材料，对水稻根系性状进行QTL定位，挖掘更多与根系性状相关的基因，以期培育出理想型株型，这对提高水稻产量和品质具有现实性意义．

1 材料与方法

1.1 实验材料

以籼稻品种华占(HZ)为父本、粳稻品种热研(Nekken2)为母本，杂交产生F1代，将得到的F1代通过单粒传法进行套袋自交，经多代连续自交后获得120个基因型和表型稳定遗传的重组自交系，组成RILs群体．双亲华占和热研具有结实率高、稻米品质好、抗病虫性强等优点．

1.2 实验方法

1.2.1 水稻种植与管理

从双亲及F12各株系中分别挑选100粒种子，对种子表面消毒处理后进行催芽．首先用70%乙醇浸泡冲洗20～30 min，重复1次；再用30%次氯酸钠消毒30 s，重复3次；最后用去离子水反复清洗种子10 min．经消毒后的种子浸入水中2 d，隔天换1次水．2 d后用浸湿的纱布包裹种子并放置于37 ℃恒温培养箱中进行催芽，48 h后挑选长势基本相同的幼芽放置于96孔水培板装置中培养．

1.2.2 三叶期根系性状测定

当幼苗生长至三叶期时，从各株系中选取中间10株无边际效应的幼苗，使用透视扫描仪(EPSON Expression 12000XL)扫描，测量每个株系的水稻根系并拍照．

利用根系分析软件WIN.RHIZO.pro.v.2002C对扫描到的根系图片进行分析，获得RILs群体三叶期总根长、根表面积、根平均直径等根系量化数据并利用Excel进行数据处理．

1.2.3 遗传图谱构建

将亲本HZ和Nekken2杂交产生的子一代以单粒传法进行连续套袋自交12代后获得RILs群体．提取并纯化第12代亲本及120个后代株系DNA后进行基因组测序，整理和分析重组自交系的测序结果，根据均匀分布在12条染色体上的4 858个标记构建遗传图谱．

1.2.4 QTL定位

在实验室前期已完成构建的高密度SNP分子标记连锁遗传图谱基础上，对已测得根系性状数据通过复合区间作图法进行数量性状(QTL)区间作图并利用Mapmarker/QTL1.1B对根系性状进行定位分析，设置阈值LOD为2.0，若在SNP标记中检测到LOD大于2.0，则认为该处存在QTL．QTL的命名遵循Mccouch等[9]提出的原则．

1.2.5 根系性状相关基因表达分析

按照总RNA提取试剂盒RNAsimple Total RNA Kit说明书的要求提取Nekken2和HZ两亲本在三叶期时根的总RNA，根据逆转录试剂盒的说明要求将RNA反转成cDNA．根据QTL显示的结果，在中国水稻基因组注释数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中查阅可能与根系性状有关的基因，初步筛选候选基因．采用qRT-PCR的方法，分析候选基因在两亲本间的表达差异，相关引物序列见表1．定量结果用2-△△CT方法进行分析[10]．利用Excel和SPSS 21.0等软件对定量实验结果进行统计分析，实验数据间差异采用t检验进行比较．

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 双亲和RIL群体的表现

对双亲及重组自交系群体的根系性状：总根长、根表面积、根平均直径进行分析后发现，在总根长中，Nekken2的总根长为46.38 cm，HZ的为42.79 cm；在根表面积中，Nekken2的根表面积为4.423 cm2，HZ的为4.227 cm2；在根平均直径中，Nekken2的根平均直径为0.322 2 mm，HZ的为0.320 2 mm．在以上3个根系性状中，Nekken2的性状表型数据均明显大于HZ的性状表型．在RILs群体的总根长、根表面积、根平均直径3个性状均呈现连续性正态分布，范围广泛且存在超亲个体(见图1)，符合QTL作图要求．

A：总根长；B：根表面积；C：根平均直径

2.2 根系性状QTL定位分析

在实验室前期已构建的分子遗传连锁图谱的基础上，对重组自交系群体三叶期时的根系性状进行了QTL检测分析，符合QTL区间作图．在本研究中，共检测到3个与总根长相关的QTL位点，分别位于第2，5，10号染色体上；检测到3个与根表面积相关的QTL位点，分别位于第2，4，5号染色体上；检测到6个与根平均直径相关的QTL位点，分别位于第4，5，9，10和11号染色体上(见表2和图2)．在总根长性状中，LOD值最大的QTL位于第5号染色体，遗传距离为100.72～101.63 cM，LOD值为4.19；根表面积中，LOD值最大的QTL位于第5号染色体，遗传距离为100.72～101.63 cM，LOD值为3.32；根平均直径中，LOD值最大的QTL位于第11号染色体，遗传距离为12.90～13.84 cM，LOD值为3.38．在以上检测到的根系性状QTL区间中，总根长和根表面积在第5号染色体上有重复区间，遗传距离为100.72～101.63 cM；根表面积和根平均直径在第4号染色体上有重复区间，遗传距离为132.54～132.79 cM．

表2 根系性状总根长、根表面积、根平均直径的QTL分析

图2 重组自交系根系性状总根长、根表面积、根平均直径的QTL位置分布

2.3 根系性状候选基因分析

根据上述根系性状QTL定位区间分布，筛选并分析与根发育相关的19个候选基因(见表3)，通过qRT-PCR表达分析发现，在总根长性状候选基因中的LOC_Os02g06400，LOC_Os02g06490，LOC_Os05g40180，在根表面积候选基因中的LOC_Os02g04590，LOC_Os11g24240，在根平均直径候选基因中的LOC_Os04g52030，LOC_Os09g29960，LOC_Os09g30120，LOC_Os09g31478在双亲HZ和Nekken2中的表达量均存在差异．在总根长中，LOC_Os02g06400，LOC_Os05g40180在Nekken2中的表达量极显著高于HZ中的表达量，LOC_Os02g06490的表达量则是极显著降低，而且以上3个基因位于效应超过3以上的区间内，最大效应值为4.19；在根表面积中，LOC_Os02g04590，LOC_Os11g24240在Nekken2中的表达量显著高于在HZ中的表达量；在根平均直径中，LOC_Os04g52030，LOC_Os09g30120，LOC_Os09g31478在Nekken2中的表达量均极显著高于HZ中的表达量，而LOC_Os09g29960的表达量则极显著下降(见图3)．

表3 根系性状总根长、根表面积、根平均直径候选基因及功能注释

3 讨 论

水稻的根系是维持水稻在整个生长周期中最重要的“隐藏器官”，对于根系的研究并未得到足够多的重视．因此，本研究利用重组自交系群体，对根系性状进行QTL区间定位并进行候选基因分析，通过挖掘根系性状基因改变地下部分的性状来培育新型理想植株，这对水稻的产量和品质具有现实性意义．研究结果显示，共检测到3个总根长、3个根表面积、6个根平均直径的QTL，分别位于2，4，5，9，10,11号染色体．

已有研究表明，水稻根系性状的调控受多种基因的控制．在已检测到的QTL区间内，通过荧光定量分析得到的总根长、根表面积、根平均直径在双亲中表达差异较明显的基因，结合水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu)和相关文献进行分析．在总根长中，LOC_Os02g06400编码1种与生长调节剂相关的蛋白，该蛋白通过外源调控，改善水稻根生育后期的活性，进而增强根的水分和养分的吸收，提高水稻的产量[11]；LOC_Os02g06490编码与液泡蛋白分选的相关蛋白，通过PIN2调节生长素的极性运输，参与植物的胁迫响应和形态生成，SNXI和重要信号分子磷脂酸(PA)结合共同调控PIN2液泡降解，进而影响根毛发育[12]；LOC_Os05g40180编码丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶stt7(叶绿体前体)，该前体通过调控细胞周期蛋白进而影响水稻籽粒的大小和产量，该表达量的上升可能会导致籽粒变长[13]．在根表面积中，LOC_Os02g04590是与生长素独立生长促进剂相关的基因，在最适浓度下，生长促进剂具

A：总根长；B：根表面积；C：根平均直径

有提高株高、茎秆粗细、根干质量等作用，进而提高株系数[14]；LOC_Os11g24240编码芥子酰葡萄糖胆碱芥子酰转移酶，该酶优先在水稻及玉米的绒毡层中表达，在绒毡层退化和花粉外壁形成中发挥重要作用[15]．有研究发现，该酶产生后优先在绒毡层中积累并参与植物体内C16/C18-ω-羟基脂肪酸氧化途径的调控，共同控制水稻花药表皮及外壁的发育[16]；LOC_Os04g52030编码LSD1亚类家族蛋白，该类家族蛋白是一类特殊的C2C2型锌指蛋白，在植物中编码特有的转录因子，介导调控细胞程序性死亡，在水稻的叶、茎和根中表达[17]；LOC_Os09g29960是一类含蛋白质的DOF锌指结构域的水稻DOF转录因子家族，在张立成等[18]的研究中发现，DOF转录因子调控水稻的抽穗期和分蘖数，进而影响水稻的产量，通过实时定量PCR发现，OsDof6在水稻根、茎、叶中均有不同程度的表达；LOC_Os09g30120编码csle1-纤维素合成酶样家族e，该纤维素合成酶受多种生长素调节，共同促进细胞壁的合成与生长[19]；LOC_Os09g31478编码生长素外排载体成分，有相关研究表明，生长素运输受到阻碍后，根的侧根及再生受到抑制，其根毛的形成和生长也有所降低[20]．

本研究结果表明，在第5号染色体检测到1个与总根长性状相关的QTL，阈值达4.19，位于RM3476～RM5970之间，这与前人挖掘到的QTL区间不重叠，且二者物理距离差距较大，推测本研究定位到的QTL可能是一个全新的位点．在第10号染色体上检测到与总根长性状相关的位点，与索艺宁等[21]的定位位于相同的染色体区域内，而且遗传图距临近，表明该区段很有可能存在控制水稻总根长性状的基因，具有较大深入研究的价值，同时为进一步挖掘控制总根长基因提供了参考价值．根平均直径的QTL定位中，在第5号染色体上定位到2个控制根直径QTL，位于C568～S14158和S2649～C2067标记区间内，这与曲志恒[22]定位到2个相关QTL中第5号染色体的区域重叠．由此可知，该区间可能存在1个控制水稻根平均直径的主效QTL．而本研究中，其余检测到的控制根平均直径的QTL与前人的研究区间不重叠，且物理距离差距较大，猜测可能是未被发现的QTL．如表2所示，在4号染色体132.54～132.79 cM上挖掘到的有关根表面积和根平均直径的QTL区间重合，说明这个QTL区间内可能存在同时控制根表面积和根平均直径的多效基因．

本研究得到了较多的新位点．在第5号染色体上定位到一个阈值达4.19的有关总根长的QTL．有2个阈值较大的QTL位点位于第5和11号染色体上，分别位于100.72～101.63 cM和12.90～13.84 cM区间，阈值分别为3.32和3.38．说明以上区间内很可能存在控制水稻根系性状的主效基因．可利用这段QTL进行水稻根系性状控制基因的挖掘，有望应用于理想株型的培育和改良．另外，研究发现在第2，4和5号染色体检测到的QTL位点不仅阈值较大，且总根长、根表面积和根平均直径的QTL区间重叠部分较多，表明这些区间内很可能存在同时控制水稻根系多种性状的多效基因．

研究利用HZ/Nekken2构建的重组自交系群体得到的3个总根长、3个根表面积、6个根平均直径的QTL，为培育水稻理想株型提供一定的理论基础．但QTL会受材料及群体的影响，因此，需开展更多关于根系性状QTL的研究，深入挖掘水稻根系性状QTL位点，寻找控制根系性状的主效基因，从地下部分的改变来培育新型理想植株，进而对提高水稻的产量和品质具有现实性意义．