ε-聚赖氨酸抗菌涂层制备及在淡水鱼保鲜中的应用

王 瑞，王 宇，王一丞，段欣欣，雷 鹏，李 莎，谷益安，孙 良，罗正山，续晓琪，吴文锦，徐 虹,*

（1.南京工业大学食品与轻工学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 211816；2.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064）

淡水鱼营养丰富，附加值高，但因微生物、内源酶以及化学作用极易腐败变质，极大限制了产品的销售范围，同时易引起食品安全重大隐患。近年来，具有抗菌功能的新型包装材料引起广泛关注。抗菌包装材料的制备方法主要分为两种，一种是基于抗菌高分子材料如壳聚糖，对其进行改性成膜；另外一种是在传统包装材料成膜过程中添加抗菌剂如纳米银、锌离子。以上方法一定程度上促进了抗菌包装材料的发展，但仍然存在膜材料力学性能不稳定、抗菌剂逸出等问题，产业化进程缓慢。

基于现有包装材料，对其表面进行抗菌功能化修饰是解决以上问题的有效途径。目前市售保鲜膜主要成分为聚乙烯（polyethylene，PE）、聚氯乙烯（polyvinylchloride，PVC）、聚丙烯（polypropylene，PP）等，材料表面均表现为高疏水特性，导致表面容易黏附细菌并形成生物膜，进而引发细菌感染和食品腐败。因此，开发简单高效的膜表面抗菌涂层技术，赋予保鲜膜表面优异的抗菌性能，不仅具有重要的科学意义，而且具有巨大的实际应用价值。

-聚赖氨酸（-polylysine，-PL）是一种含有25～30 个赖氨酸残基的新型绿色食品防腐剂，具有广谱抗菌活性和良好的生物安全性，于2014年经卫生健康委员会批准作为新型食品防腐剂。-PL主要通过破坏细菌的细胞膜，从而破坏细胞结构，-PL进入细胞内使DNA受损，从而使细胞死亡，对食源性细菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有较高的抗菌活性。目前我国已经批准-PL作为食品防腐剂应用于焙烤制品、熟肉制品以及果蔬汁生产中。最重要的是，与其他杀菌剂相比，-PL对哺乳动物细胞没有任何副作用。然而，-PL为高亲水性聚合物分子，在酸性和中性条件下通过-氨基的质子化以聚阳离子形式存在，无法与疏水保鲜膜表面稳定附着，难以发挥抗菌功效，严重限制了其应用。

本研究以市售PE保鲜膜为基材，-PL和阴离子表面活性剂双(2-乙己基)磺基丁二酸钠（sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate，AOT）为原料，采用一步静电组装技术，制备-PL-AOT复合物，该复合物不溶于水，可溶于乙醇，进而在保鲜膜表面形成稳定抗菌涂层（图1）。通过对复合物分子结构及涂层理化性能进行表征，评价其稳定性；进一步以草鱼鱼片为研究对象，研究抗菌涂层对其实际保鲜效果，旨在为保鲜膜表面抗菌涂层在淡水鱼保鲜应用提供理论依据和技术参考。

图1 ε-PL-AOT抗菌涂层及抑菌机理示意图Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of ε-PL-AOT antibacterial film

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

活体草鱼购于南京水产批发市场。

菌株：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（ATCC 25922）由南京工业大学农业微生物实验室提供。

LB培养基：将10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl、1 000 mL蒸馏水混合均匀，于121 ℃灭菌15 min，得到LB液体培养基，备用；LB固体培养基在LB液体培养基的基础上加入培养基质量1.5%的琼脂。

-PL（食品级，纯度＞99%） 南京轩凯生物科技有限公司；AOT 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇天津市富宇精细化工有限公司；蒸馏水 湖南科尔顿水务有限公司；盐酸 扬州沪宝化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

85-1型磁力搅拌器 金坛区白塔新宝仪器厂；XFP01-B型注射泵 苏州讯飞科学仪器有限公司；FD-1A-50型真空冷冻干燥机 德国Marin Christ公司；TGL-16型台式高速冷冻离心机 四川蜀科仪器有限公司；SK6210HP型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；LRH-150型生化培养箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD双人超净工作台 苏州净化设备有限公司；AV 400型核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）仪 德国布鲁克公司；Nicolet iS5型傅里叶变换红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技公司；ESCALAB MKII型X-射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）仪 英国VG公司；HLD数显拉力计 乐清市艾德堡仪器有限公司；DSA100接触角测试仪 德国克吕士公司；CH-1-S千分手式薄膜测厚仪 上海六菱仪器厂。

1.3 方法

1.3.1-PL-AOT复合物的合成与结构表征

将-PL溶于pH 2的盐酸溶液中至-PL完全溶解，质量浓度为1.5 g/100 mL；同时将AOT溶于体积分数40%的乙醇溶液中至AOT完全溶解，质量浓度为3 g/100 mL。随后，将AOT的乙醇溶液滴加至-PL溶液中，并搅拌反应，反应30 min，离心（10 000 r/min、15 min）并用超纯水洗3 次，冷冻干燥12 h得到-PL-AOT复合物。利用H NMR对其分子结构进行鉴定，D-二甲基亚砜（(CD)SO）作为溶剂。

1.3.2 保鲜膜表面抗菌涂层构建

以普通市售保鲜膜为基材（PE保鲜膜，5 cm×5 cm），先在体积分数75%乙醇溶液中超声清洗20 min，再用超纯水洗10 min，室温干燥备用。将-PL-AOT复合物溶解在无水乙醇中，得到2%（质量分数，下同）的-PL-AOT乙醇溶液，将该溶液喷涂于备用的PE保鲜膜表面，随后取出常温风干，乙醇挥发后即形成-PL-AOT复合物抗菌涂层（样品记为PE/-PL-AOT）。同时，将2%的-PL乙醇溶液及AOT乙醇溶液分别喷涂到PE保鲜膜上，以其及PE保鲜膜作为对照样（样品分别记为PE/-PL、PE/AOT、PE）。

1.3.3 抗菌涂层的表征分析

采用傅里叶变换红外光谱仪测定涂层成分的化学结构，扫描范围为400～4 000 cm；利用XPS仪对涂层表面元素组成进行分析，检测条件为：40 kV、50 mA、CuKα辐射、步宽0.02°、扫描范围4°～70°；采用接触角测试仪对涂层表面静态水接触角进行测定，设置滴加去离子水液体的体积为2 μL，通过CCD软件记录液滴形状，并获取所测得的接触角；将膜进行裁剪成长方形（4 mm×25 mm），剪裁后用薄膜测厚仪测定裁好的膜中间处3 点的膜厚，取平均值即为膜厚；采用数显拉力计进行膜拉伸实验，拉伸速度为50 mm/min，观察实验曲线并记录实验数据，在室温下测定本系列样品膜的断裂伸长率、拉伸强度，平行样共3 个，结果取平均值。

1.3.4 涂层表面抗菌性能实验

菌液制备：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的单菌落接种至LB液体培养基中，培养12 h得到细菌菌液，离心（3 000 r/min、10 min）去除上清液，用灭菌好的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2～7.4，下同）悬浮细菌浓度至1×10CFU/mL，随后再用LB液体培养基将细胞稀释到1×10CFU/mL。

抗菌定量实验：采用JIS Z 2801标准对样品中的活菌数进行统计。首先制备2 种保鲜膜基材（PE和PE/-PLAOT，5 cm×5 cm），并分别置于6 孔板中，在膜样品表面中心区域，滴加20 μL上述细菌悬浮液，用PE保鲜膜和PE/-PL-AOT抗菌膜覆盖，使得菌液均匀铺展开。将带有不同样品的孔在37 ℃条件下孵化24 h，随后将样品取出，加入3 mL无菌PBS超声2 min，使得黏附于样品膜表面的细菌脱落，然后将其按照一定的倍数稀释后，涂布平板。37 ℃过夜培养后，对表面形成的细菌菌落进行计数统计。

1.3.5 淡水鱼肉保鲜效果评价

取新鲜活体草鱼，敲击致晕，宰杀后去头、去内脏，取鱼体两侧鱼片。用预冷的无菌蒸馏水清洗后沥干其体表水分，将鱼背部白肉切成约4 cm×3 cm×1.5 cm鱼块。将其平均分成3 组，分别用PE保鲜膜和PE/-PL-AOT抗菌膜包裹，将处理后的样品在37 ℃恒温箱中放置24 h后，参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的平板涂布法对鱼肉表面的菌落总数进行测定。

1.4 数据处理和分析

实验均平行测定3 次，采用SPSS Statistic 17.0软件对数据进行方差分析，＜0.05表示差异显著，结果以平均值±标准差表示。采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 ε-PL-AOT复合物核磁氢谱结果

-PL与AOT两者通过静电相互作用及疏水相互作用可快速形成白色沉淀，该-PL-AOT复合物可溶解在乙醇溶液中，而不溶于水中。由图2可知，在8.024处的峰是连接在氨基C上的质子峰（D，—C—NH）。在2.936处的峰则是连接C和N的亚甲基上的质子峰（B，C—CH—N）。另外，在0.858处的尖形分裂峰分别对应着AOT主链上甲基质子和支碳链上的甲基质子（H，C—CH）。各质子数目基本与预测结构符合，此外，通过各质子峰的面积之比，如AOT主链碳次甲基质子峰面积（2.301）约为-PL伯胺质子峰面积（1.000）的2 倍，可以看出-PL-AOT复合物是等物质的量反应形成的。

图2 ε-PL-AOT的1H NMR图谱Fig. 2 1H NMR spectrum of ε-PL-AOT

2.2 ε-PL-AOT涂层功能化抗菌保鲜膜

-PL-AOT为水不溶性复合物，因此利用乙醇溶解后喷涂于PE保鲜膜表面，随后常温风干，乙醇挥发后在保鲜膜表面形成复合物涂层。如图3所示，-PL-AOT涂层处理的保鲜膜表面出现白色沉积物，但不影响保鲜膜本身的透明度，透光性较好。

图3 抗菌膜的实体图Fig. 3 Photograph of antibacterial film

2.3 ε-PL-AOT涂层红外光谱结果

为了验证-PL-AOT在保鲜膜表面形成了稳定涂层，采用红外光谱对其表面分子结构进行表征。AOT磺酸根（—SO

）基团中S＝O键的对称伸缩振动峰在1 051 cm左右，不对称伸缩振动峰在1 300～1 100 cm左右。如图4所示，PE/-PL-AOT样品在1 046 cm处出现特征峰，为AOT中S＝O键的对称伸缩振动，说明磺酸根与-PL氨根离子之间的电荷作用会使S＝O键的对称伸缩振动峰发生蓝移，该结果证实-PL-AOT在保鲜膜表面形成了稳定的涂层。

图4 ε-PL-AOT复合物及其对照样品涂层红外光谱Fig. 4 Infrared spectra of ε-PL-AOT coating and control samples

2.4 ε-PL-AOT涂层元素分析结果

如表1所示，与PE保鲜膜相比，-PL-AOT涂层处理的保鲜膜表面N和S元素所占百分比明显增加，-PL-AOT复合物通过与PE之间的疏水作用力在保鲜膜表面形成稳定涂层，因此结构中含有大量的N和S，证实PE膜表面-PL-AOT涂层的构建成功。PE保鲜膜、PE/-PL和PE/AOT表面以C元素为主，这是因为PE保鲜膜为聚乙烯组成，主要元素组成为C元素，-PL和AOT为水溶性，无法在保鲜膜表面形成稳定涂层。PE/-PL-AOT及其对照涂层表面元素组成的XPS谱如图5所示。

表1 ε-PL-AOT及其对照组涂层的元素相对含量Table 1 Element contents of ε-PL-AOT coating and control samples

图5 PE/ε-PL-AOT及其对照样品的XPS谱图Fig. 5 XPS spectra and high resolution XPS N 1s and S 2p spectra of ε-PL-AOT coating and control samples

2.5 ε-PL-AOT涂层表面亲水性

涂层表面的亲水性是判断-PL-AOT涂层成功的另外一个关键指标。如图6所示，因PE保鲜膜本身为疏水材料，表面接触角为113.7°，PE/AOT和PE/-PL的接触角与PE保鲜膜无明显差异，证明涂层在水洗过程被洗掉，无法与膜表面稳定结合。而-PL-AOT涂层接触角降至39.91°，亲水性明显增加，主要原因在于-PL-AOT通过疏水作用力与PE疏水表面相互作用形成稳定涂层，AOT的疏水烷烃链与PE分子形成稳定键合，-PL亲水分子暴露在涂层上端，表现出高度的亲水性。

图6 ε-PL-AOT涂层及其对照样接触角测试Fig. 6 Contact angle of ε-PL-AOT coating and control samples

2.6 ε-PL-AOT涂层抗菌保鲜膜的力学性能分析结果

如表2所示，加入-PL-AOT对抗菌保鲜膜的厚度、拉伸强度和断裂伸长率基本没有影响，其中，相比较PE保鲜膜，抗菌保鲜膜的厚度没有发生变化；而拉伸强度和断裂伸长率虽稍有降低，但总体变化较小，对抗菌保鲜膜的力学性能影响较小。总体而言，在PE保鲜膜中加入-PL-AOT后，该涂层抗菌保鲜膜仍具有良好的力学性能。

表2 ε-PL-AOT涂层抗菌保鲜膜的力学性能Table 2 Mechanical properties of antibacterial film coated with ε-PL-AOT

2.7 ε-PL-AOT抗菌效果评价

2.7.1-PL-AOT抗菌涂层的抑菌效果

为验证-PL-AOT抗菌涂层的抑菌效果，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为研究对象，对其抑菌率进行评价。如图7所示，肉眼可直观观察到PE膜处理样品和PE/-PL-AOT膜处理样品的菌落数量具有明显差异。由于PE膜无抗菌功能，24 h后表面大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数分别为6.78（lg（CFU/g））和6.87（lg（CFU/g））；而-PL-AOT抗菌膜表面细菌数量远低于对照组，分别为2.94（lg（CFU/g））和2.73（lg（CFU/g）），证明了该涂层具有广谱抗菌功能。其主要杀菌机制为接触杀菌，涂层表面-PL分子接触细菌时可以破坏细菌细胞膜的完整性，导致细胞膜通透性改变，细菌内容物泄漏，进而裂解死亡。

图7 ε-PL-AOT抗菌涂层对大肠杆菌（A）和金黄色葡萄球菌（B）的抑制效果Fig. 7 Inhibitory effect of ε-PL-AOT antibacterial coating on Escherichia coli (A) and Staphylococcus aureus (B)

2.7.2-PL-AOT抗菌涂层对淡水鱼保鲜效果

肉品腐败变质的主要原因是微生物大量生长代谢导致蛋白质分解。如图8所示，肉眼可直接观察到3 种处理方式样品的菌落数量有明显差异，空白对照组（无保鲜膜）和PE保鲜膜处理组的细菌菌落总数均高于1×10CFU/g，根据GB 4789.2—2016，肉制品一级鲜度的菌落总数低于1×10CFU/g，其为变质肉。PE/-PL-AOT抗菌膜处理组表现出明显保鲜效果，在平板上肉眼无可视菌落，菌落总数低于1×10CFU/g，满足GB 4789.2—2016中肉制品一级鲜度标准，以上结果表明-PL-AOT抗菌涂层在淡水鱼常温保鲜领域具有很好的应用前景。

图8 ε-PL-AOT抗菌涂层对鱼肉保鲜效果Fig. 8 Effect of ε-PL-AOT antibacterial coating on total bacterial count of grass carp fillets

3 结 论

本研究以天然抗菌高分子材料-PL和表面活性剂AOT为原料，创新采用一步静电组装技术，制备稳定的保鲜膜涂层。该涂层对以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为代表的细菌具有显著的抗菌性能，同时在以草鱼鱼肉为代表的淡水鱼鱼肉类保鲜中，也显示出较好的延长货架期性能。该技术解决了水溶性抗菌材料在疏水保鲜膜表面难以稳定附着的难题，对其他抗菌高分子材料如壳聚糖等的抗菌包装材料开发具有指导意义；同时具有工艺简单、抗菌功效显著的优势，在食品包装领域具有广阔的开发和应用前景。