呕吐毒素的食品污染、吸收代谢及肠道毒性研究进展

郭红艳，杨家庆，刘 园，莫妮娜，贾惠婷，陈 焱，郑立友,*

（1.安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽 芜湖 241000；2.广州市番禺粮食储备有限公司，广东 广州 510000；3.中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209）

呕吐毒素又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），由禾谷镰刀菌（）、黄色镰刀菌（）和克鲁克威尔镰刀菌（）产生，具有强烈的催吐作用。1972年日本人在食用含镰孢菌的发霉大麦时，首次发现DON的催吐作用。DON为含3 个游离羟基的极性化合物，为无色薄晶体，分子式CHO，相对分子质量296.3，溶于水和极性有机溶剂（如氯仿、乙醇、乙腈、甲醇、乙酸乙酯等）。DON在100 ℃（60 min）保持稳定，在180 ℃（26 min）可降解50%，在200 ℃（6 min）和220 ℃（4 min）可降解50%。环境因素如温度、水分活度和pH值是影响DON生成的关键因素。此外，赤霉病的发病率一度被认为和DON的浓度呈正相关。

DON被国际癌症研究机构列为3类致癌物，世界上超过40 个国家对食品和饲料中的DON制定了相关限量标准。2011年，联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会规定DON（含乙酰化形式）的暂定每日最大耐受量（provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI）为1 µg/（kg·d），2017年欧洲食品安全局规定DON的每日耐受摄入量（tolerable daily intake，TDI）为1 µg/（kg·d）。目前，我国已制定了粮食、食品（谷物及其制品）、饲料原料及饲料产品中的DON限量标准（表1）。

表1 我国制定的粮食、食品及饲料中DON的限量标准Table 1 China’s safety limits for DON in grain, food, and feed

本文从食品链、人群、地域等不同角度分析国内外粮食和食品中DON的污染现状及特性，并由污染特性引出DON衍生物；进一步阐述DON的机体及分子吸收和代谢机制；针对DON作用的第一道器官组织——肠道，分别从细胞、动物和人体层面介绍DON（含衍生物）的肠道毒性效应，并对今后的研究做出展望。

1 DON的食品和粮食污染

1.1 食品链

从食品链角度而言，真菌毒素的污染可发生于作物的产前收获、存储和加工过程任一阶段，且在这一生产过程中，真菌毒素的含量呈动态变化（图1A）。DON主要污染小麦、大麦、玉米和大米等谷物，由于DON对研磨和热处理等加工工艺具有耐受性，故其在整个食品生产链中广泛存在，且难以去除。例如，2019年珠海市的DON中毒事件，起因为市售面条DON污染，生面条中DON含量高达6 856～11 982 µg/kg。

图1 食品链中的DON[8-9]Fig. 1 DON in food chain[8-9]

食品生产链中DON的量变与质变相生相随。如图1B、C所示，在物理、化学等加工因子的作用下，DON往往发生迁移、转化、基质结合或稀释现象，其自由态含量发生变化，甚至转化为DON衍生物，温度、加热时间、酶助剂、食品成分及食品尺寸等是最主要的影响因素。这种质变或量变现象似乎与DON的稳定性相悖，推测可能与食品基质的复杂性有关。与此同时，少量研究报道了相反的实验结果，即加工因子的影响有限，食品中的DON保持一定的稳定性。相悖的研究结论可能源于食品基质、检测方法、统计分析方法、毒素分布规律和加工工艺等产生的影响，因而，食品加工链中DON的稳定性仍需探索和确证。

食品原料的毒素污染情况很大程度上决定了加工过程中各种副产物、半成品或成品的毒素污染水平，且DON的含量变化及分布规律可能受原料品种的影响，如BRS 374品系小麦磨粉后麸皮与磨碎小麦的DON水平相当，是面粉中DON含量的2 倍，而BRS parrudo小麦磨粉后麸皮与面粉的DON含量相当。一般而言，加工成品的毒素含量低于食品原料中的毒素含量（表皮副产物除外），但加工过程中真菌毒素变化规律复杂。以小麦面包的生产为例，初加工过程中的清洗、分选、去壳和磨粉等导致DON的再分配和再分布，但无法破坏其结构，DON在外层副产品富集。烘焙和发酵工艺对DON影响显著，发酵过程中纤维素酶、蛋白酶、木聚糖酶和面粉改良剂等添加物导致DON含量升高，而无酶添加则降低DON含量。不同烘焙条件下（加热温度、加热时间、食品尺寸等），DON含量从升高90%到降低90%不等，且伴随隐蔽态DON（如Nor DON）出现。此外，亚硫酸氢钠等食品添加剂降低DON含量，而山梨酸、柠檬酸等添加剂则对DON含量无明显影响。根据德国联邦研究所食品安全部门的报道，面包生产过程中的清洗、研磨、发酵和烘焙环节DON含量分别为初始含量的0.1～0.9、0.3～1.0、0.2～1.8、0.5～2.0 倍。

值得关注的是，DON在食品生产链中可转化为隐蔽态形式，即DON衍生物，已报道的DON热加工或非热加工产物有D3G、DOM-1、Nor DON A-F、DONS、isoDON、DON-lactone、Hy-DON-lactone等（图1C）。当前，隐蔽型毒素的鉴定、含量检测及毒性研究仍在进行中，已报道的研究结果十分有限。食品加工过程中是否存在其他未知毒物，隐蔽态毒素是否会进一步转化，有待进一步研究。除上述食品加工过程中形成的化学型隐蔽态形式外，DON经生物转化（植物、动物、微生物）形成的衍生物包括3-乙酰-DON（3-acetyl-DON，3ADON）、15-乙酰-DON（15-acetyl-DON，15ADON）、3-酮基-DON（3-ketone-DON，3-keto-DON）、3-异构-DON（3-epimerization-DON，3-epi-DON）、DOM-1葡萄糖苷酸（DOM-1-glucuronide，DOM-1-GA）、DON-3-葡萄糖苷酸（DON-3-glucuronide，D3GA）、DON-15-葡萄糖苷酸（DON-15-glucuronide，D15GA）、DON-8-葡萄糖苷酸（DON-8-glucuronide，D8GA）、DON-7-葡萄糖苷酸（DON-7-glucuronide，D7GA）、DON-谷胱甘肽（DON-glutathione，DON-GSH）等。

1.2 地域

DON的污染在世界范围内呈现地域特点和人群特点。首先，从地域角度分析，DON的污染情况与国家或地区的经济发展水平、气候及饮食习惯等有关。值得注意的是，DON的污染水平在中国、伊朗、黎巴嫩、坦桑尼亚、埃塞俄比亚、尼日利亚和南非等发展中国家较高，而污染率在德国、西班牙、荷兰、法国和意大利等发达国家也较高。其中，非洲地区居民DON日摄入量最高，这可能与当地饮食单一、真菌毒素风险认知不足及气候条件等有关。世界五大洲的调研数据显示，非洲地区玉米食品及亚洲地区的面包和小麦面粉DON污染水平极高，为500～800 µg/kg，欧洲地区面包、面粉、意大利面、蛋糕和披萨中的DON含量也达到100～200 µg/kg。

DON广泛存在于谷物及其制品、牛奶及其制品和啤酒等食品中，以谷物的污染最为严峻。据国际粮农组织/世界卫生组织报告，世界上42 个国家的23 980 份谷物样本中，小麦、玉米、大米、大麦、燕麦和黑麦中DON的平均含量分别为9 900、4 772、183、6 349、537 µg/kg和190 µg/kg。且近年来的尿液生物标志物分析显示，人群中约80%的个体暴露于DON。可见，DON已成为全球检出率最高的真菌毒素之一，其对粮食及食品的污染是全世界共同面临的严峻问题。

我国地域广阔，部分地区横跨不同气候区，因而居民对毒素的暴露水平存在较大差异。在几种易发生DON污染的粮食中，我国居民的膳食暴露源主要为小麦、玉米、大米和燕麦。国家食品安全风险监督系统2020年的数据显示，2010—2017年，我国30 个省、自治区和直辖市的15 004 份食品样本中，10 192 份小麦粉、1 750 份玉米粉、2 170 份大米以及892 份燕麦片中的DON（含乙酰化）平均污染水平分别为250、161、10、20 μg/kg，阳性率分别为77%、80%、26%和24%，其中我国居民86%的DON膳食暴露量源自小麦粉。尽管人群平均DON暴露水平和中值暴露水平分别为0.61、0.36 μg/（kg·d），低于PMTDI（1 µg/（kg·d）），但暴露呈现地区聚类特性和年龄特性，高暴露聚集区位于北方，而东南部地区食品DON污染严重，江苏、甘肃、陕西、山西地区DON人群暴露水平超出PMTDI。江苏、甘肃、陕西、山西、内蒙古、河北和新疆地区小麦粉DON平均暴露水平分别高达1.54、1.54、1.55、1.17、0.95、0.94 μg/（kg·d）和0.93 μg/（kg·d），安徽、四川、河南和浙江地区小麦粉DON平均暴露水平分别为0.86、0.70、0.60 μg/（kg·d）和0.59 μg/（kg·d）。不同年龄段人群暴露水平呈现显著性差异，18 岁以下（3～6、7～12、13～17 岁）、18～59 岁及60 岁以上人群的DON（含乙酰化）平均暴露水平分别为1.02～0.65、0.56 μg/（kg·d）和0.48 μg/（kg·d）。2018—2019年，我国六大谷物主产区田间小麦的DON含量为0.000～7.200 mg/kg，平均含量为1.335 mg/kg，超出限量标准，可见DON污染形势严峻。

1.3 人群

从人群角度分析，真菌毒素的暴露水平与年龄有关，因此特殊人群，如婴幼儿和儿童，应当被更多关注。

一方面，婴幼儿食品的加工原料较为单一，谷物是婴幼儿食品原料的重要来源，而DON对谷物的污染最为严峻，因而婴幼儿食品更容易受DON污染；另一方面，婴幼儿饮食单一，生长快速，且体质量较轻，解毒能力没有发育完全，毒素暴露年限更长，因而对DON的暴露风险更为严峻。近年来，婴幼儿对DON的易感性逐渐引发学者的关注：2010—2017年，我国3～6 岁和7～12 岁儿童对DON（含乙酰化）的膳食暴露水平（含小麦粉、玉米、大米、燕麦）分别为1.02、0.88 μg/（kg·d），高于成人、老人和青年，为所有年龄段中暴露风险最高的人群；2018年，突尼斯婴儿谷物食品中DON阳性率为38%，DON暴露水平约为0.367 μg/（kg·d）；2020年，奥地利和捷克婴幼儿谷物食品和配方奶粉中DON检出率为7%，暴露水平约为0.33 μg/（kg·d）。此外，葡萄牙、意大利、荷兰、厄瓜多尔等地区的婴儿食品中DON阳性率为26%～44%，暴露水平为0.004～0.110 μg/（kg·d）。

2 DON的吸收、转运和代谢

2.1 机体吸收、代谢和解毒

机体对DON的吸收非常迅速，经口摄入15～30 min即可在血液检出DON，且DON代谢物瞬时分布于血浆、肌肉、腹部脂肪、胃、肠、肝、肾、心脏、脑和脾等组织。肠道系统对DON的吸收程度与物种类别、年龄、性别息息相关，DON在猪、鼠、牛、羊的肠道吸收率从7%到89%不等，差异显著，这与肠道菌群的分布位置及pH值有较大关系。

肠道菌群可将DON转化为无毒的脱环代谢物DOM-1，因此，肠道菌群分布位置在小肠之前或之后对DON的口服生物利用度、口服敏感性及代谢影响极大。猪等单胃物种的肠道菌群主要分布在小肠之后的结肠中，小肠对DON高度吸收，因此大部分DON可穿过肠道上皮，到达血液腔；仅一部分到达结肠的DON被肠道菌群转化为DOM-1。因此，单胃物种摄入DON后，只有少量的DON以DOM-1的形式通过粪便排出，大部分DON在肝脏经II相代谢反应，以DON葡萄糖苷酸、DON、DOM-1-GA和DOM-1的形式通过尿液代谢排出（图2A、B）。鉴于猪肠道和人体肠道的相似性，研究人员推测人体也可高效吸收DON。尽管尚无人体内DON毒代动力学的确切数据，但人肠上皮细胞的体外模型已被广泛研究和应用，该模型评估人体内DON的口服生物利用度为50%～60%。

需要注意的是，并非所有肠道菌群都对DON具有解毒能力。有研究认为，人体和猪的原始肠道菌群并不具备DON解毒能力，相反，DON暴露诱导了解毒菌群的出现。此外，DON可在人体内经I相代谢和II相代谢途径解毒，细胞色素P450氧化是DON最重要的解毒途径。DON经P450氧化形成I相代谢物，并进一步通过谷胱甘肽--转移酶和还原型谷胱甘肽形成缀合物（图2C）。

2.2 分子吸收和外泵

分子层面上，糖蛋白PgP是DON的外泵蛋白，负责DON及其衍生物的运出和排泄；然而，究竟DON如何进入细胞，目前仍然没有确切的研究定论。研究认为，DON可能通过膜转运蛋白、内吞或胞饮以及脂质的膜扩散途径进入细胞，但通过膜扩散的可能性极低（图2D）。尽管DON的细胞毒性效应可能依赖于其直接结合膜受体的能力，但理论上只有分配系数log值接近0或为正值的分子才能通过脂质扩散进入细胞，而DON在中性pH值条件下log值为-0.97。

图2 DON及其衍生物的吸收、分布和代谢转化Fig. 2 Absorption, distribution, and metabolic transformation of DON and its derivatives

3 DON的毒性

B6C3F1小鼠经口摄入和腹腔注射DON的半数致死剂量为79、49 mg/kg。体内、体外研究证实，特定剂量的DON影响肠道功能、免疫系统、内分泌系统和神经系统，毒性症状的强弱取决于多种因素，如污染水平、年龄、性别以及其他化学物质可能存在的协同效应。低至中等剂量的急性口服DON引发腹痛、恶心、呕吐、腹泻和肠胃炎等不良反应；高剂量DON严重损害胃肠道黏膜淋巴样和上皮细胞，导致出血、内毒素血症和休克；慢性DON暴露导致体质量增加减少、厌食和营养吸收率的改变。氧化应激、线粒体凋亡、内质网应激、核糖体应激、脂质过氧化和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等是DON等诱导毒性效应的关键作用机制。

目前DON衍生物的毒性研究（图3）多见于细胞毒性、肠道毒性、基因毒性和免疫毒性，而神经毒性、生殖毒性和肾脏毒性研究相对较少，研究对象集中于乙酰化和糖基化DON，仍然缺少多数衍生态DON的毒理数据。其中，乙酰化DON具有细胞毒性、基因毒性、肠道毒性和免疫毒性，D3G具有基因毒性和肠道毒性，DOM-1具有生殖毒性、细胞毒性和肠道毒性和免疫毒性。

图3 DON及其衍生物的毒性[8]Fig. 3 Toxicity of DON and its derivatives[8]

4 DON的肠道毒性

尽管肠道系统对DON不太敏感，DON引发肠道毒性效应（≥1 μmol/L）的剂量水平往往高于其引发免疫毒性（≥1 nmol/L）和神经毒性（≥10 nmol/L）的剂量水平，但肠道是经口摄入DON毒性作用的第一道器官组织，且暴露于高剂量水平DON。目前，DON的肠道毒性研究模型多见于肠道上皮细胞模型（HT-29、Caco-2细胞）、空肠外植体和猪、鼠、鸡等动物模型。其中，猪和人体对DON的敏感性一致，呕吐阈值为50～100 g/kg。

4.1 DON的肠道毒性效应

大量细胞模型及动物模型的研究结果表明，真菌毒素的膳食暴露与慢性肠道炎症有关。除影响肠道功能外，DON诱导肠道炎性因子的释放和肠道相关激素的表达，导致全身免疫系统和内分泌-脑系统的改变；而DON引起的炎症反应又反向作用于肠和血脑屏障，增加其渗透性，最终影响肠道对DON生物利用度。在信号传递方面，DON暴露诱导著名的双向肠-脑轴（图4A）。DON诱导的肠道信号通过感觉神经、细胞因子、肠道激素和微生物因子4 种信号途径传递到大脑，大脑信号进一步通过自主神经和神经内分泌输出被反向传递到肠道，研究人员推测DON通过5-羟色胺信号通路诱导厌食和体质量减轻。

图4 DON及其衍生物的肠道毒性Fig. 4 Intestinal toxicity of DON and its derivatives

DON的肠道毒性效应主要表现为缩短肠道绒毛高度、损害肠道组织完整性、抑制肠道细胞分化、破坏肠道菌群平衡，以及营养吸收减少、炎症反应、上皮先天免疫受损等系列负面效应。DON衍生物的研究多见于乙酰化形式（3/15ADON）、糖基化形式（D3G）及去环产物（DOM-1）（图4B）。3/15ADON影响肠道绒毛高度和肠道通透性，诱导肠道细胞凋亡和组织病理学损伤；D3G诱导肠道细胞凋亡并导致厌食。值得注意的是，15ADON引起的肠道通透性改变、肠道细胞凋亡和组织病理学损伤程度超过DON。

4.2 DON肠道毒性效应的上皮细胞模型和空肠外植体模型研究

肠道上皮的完整性对于防止毒素侵害、保证营养物质吸收至关重要。小肠和结肠上皮细胞在基底外侧暴露于大量到达血室的DON，为保持肠道屏障的完整性和功能性，肠道上皮细胞需要保持恒定的再生状态，这种再生状态依赖于上皮细胞的增殖和凋亡以及成熟和分化。

DON影响肠道上皮细胞的增殖、修复和更新，进而破坏屏障完整性。三叶因子不具有调节细胞增殖或分化的功能，但其介导的细胞迁移是上皮修复过程中必不可少的环节。在HT29-16E细胞中，极低剂量的DON即可抑制三叶因子家族的mRNA水平表达（半抑制浓度243～387 nmol/L），从而影响肠道细胞的伤口愈合能力；在HT-29细胞模型中，DON上调活性氧水平、Ca和线粒体膜电位，影响MAPK及其下游通路表达，诱导细胞凋亡。肠道上皮通过上皮细胞之间的紧密连接形成机体抵御外源危害的坚固防线，在Caco-2细胞模型中，DON抑制细胞分化，介导跨膜电阴降低，伴随与其呈负相关的细胞旁通透性增加，这种肠道屏障及通透性的改变依赖于MAPK通路和紧密连接的调节。此外，DON影响核糖体生物合成及转录、RNA合成/加工/成熟、胆固醇代谢、蛋白质消化吸收及代谢相关的基因表达，以及糖代谢（三羧酸循环）、脂代谢（过氧物酶体等）、紧密连接和黏附连接、氨基酸代谢、蛋白质合成相关的蛋白表达。

外植体包含了上皮组织中的所有细胞种类，可对来自单一供体的器官进行不同暴露设计，因而引起毒理学研究的特别关注。外植体模型主要包括猪空肠外植体和鸡空肠外植体等。在猪空肠外植体中，DON诱导绒毛萎缩或坏死，绒毛顶端肠细胞和上皮细胞微绒毛损伤，细胞旁通透性增加，跨上皮电阴降低，IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-8和IL-22等促炎因子上调，E-钙黏蛋白表达减少，环氧化酶表达上调，脂质过氧化增加，细胞抗氧化能力降低。在肉鸡空肠外植体中，DON减少肠细胞及细胞核的尺寸，增加细胞质空泡化和绒毛顶端脱落，上调细胞凋亡比例。

4.3 DON肠道毒性效应的动物模型研究

大量动物模型的研究结果表明，DON引发空肠、回肠、小肠等肠道组织损伤，改变肠道通透性，并诱导肠道炎症反应。在小鼠模型中，DON导致每日摄食量和每日体质量增加量减小，小肠长度和十二指肠/空肠质量减少，空肠黏膜塌陷和细胞脱落，空肠跨膜电阴和二胺氧化酶降低，空肠、隐窝和肠系膜的紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin下调、核增殖抗原Ki67和增殖细胞核抗原上调，与肠道再生功能有关的Wnt/-catenin信号通路受阴。在猪模型中，DON导致回肠、空肠、十二指肠超微结构受损，肠绒毛高度、隐窝深度（空肠除外）降低，空肠和回肠组织中的核因子（nuclear factor，NF）-κB p65和NF-κB抑制蛋白α（NF-κB inhibitor alpha，IκBα）表达水平上调、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达水平下调，空肠组织的、干扰素γ、的mRNA表达水平上调、表达下调，小肠黏膜中的NF-κB、IκBα、环氧化酶2表达异常，ZO-1蛋白表达水平降低。在草鱼幼鱼模型中，DON增加肠道活性氧水平，降低肠道抗氧化能力，下调谷胱甘肽过氧化物酶1、锰超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的mRNA表达水平，激活细胞死亡受体和线粒体凋亡通路，通过下调紧密连接蛋白、和////和上调/的mRNA表达水平导致肠道物理屏障受损。在肉鸡模型中，DON导致肠道细胞旁通透性改变，空肠和盲肠甘露醇泄漏增多，大肠杆菌异位增加。

此外，DON影响肉鸡、猪、鼠、鲈鱼等动物模型的肠道微生物的组成和丰度，引发肠道炎症。DON抑制链球菌的生长，不影响大肠杆菌的生长，但以时间和剂量依赖的方式加剧大肠杆菌素的遗传毒性。在小鼠模型中，DON显著干扰短链脂肪酸代谢，降低瘤胃菌科和毛螺菌门丰度，增加脱硫弧菌门丰度；在鲈鱼模型中，DON增加厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门的丰度，降低梭杆菌门丰度，引起肠道超微结构的损伤。肠道微生物群被认为是研究DON肠道免疫毒性的潜在媒介。

4.4 DON对人体肠道组织的影响研究

基于PMTDI值、毒性效应剂量及低安全系数（0.6～100.0）的分析认为，相较于黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A或伏马菌毒素B，膳食暴露水平的DON是影响人体肠道组织的更为严重的风险因子，尤其对于肠道炎性疾病和乳糜泻患者。实际污染水平的DON对人体肠道系统的影响为：1）引发肠道细胞DNA修饰和基因突变；2）改变肠道菌群；3）改变肠黏液的产生及组成；4）改变肠道屏障功能，增加肠通透性，虽然这种肠道屏障的改变可能与DON抑制蛋白质合成有关，但Claudins表达的改变表明DON对肠道屏障的破坏与紧密连接有关；5）增加细菌和肠腔抗原的跨上皮通道，在不改变肠通透性的情况下，增加共生细菌穿过上皮细胞的移位；6）调节肠上皮促炎因子（如IL）的分泌；7）增加微生物和自身抗原的IgA生成；8）干扰Th1/Th2免疫平衡等（图4C）。

5 结 语

DON的污染呈现地域特性、人群特性和食品加工链特性，食品加工因子诱导DON的量变和质变。DON的代谢和毒性机理研究已经广泛开展，但DON的分子吸收机制仍未有确切定论。膳食暴露水平的DON是严重影响人体肠道组织的风险因子，DON在不同生物模型诱导的肠道毒性效应已有系统研究，但DON的肠道信号传导机制及其对肠道菌群的影响仍有待探索。此外，DON衍生物如乙酰化DON也呈现一定肠道毒性作用，15-ADON的肠道毒性效应甚至强于DON，但多数DON衍生物的肠道毒性研究鲜见报道，这可能受限于当前衍生物的检测、生产和纯化技术研究现状。未来研究应当关注DON的分子吸收机制、肠道毒性信号转导及其对肠道菌群的影响，并开展DON衍生物的毒理学研究。