超声波联合杀菌剂杀菌的研究进展

李银汇，王文骏,2,3，吕瑞玲,2，刘东红,2,3,*

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058；2.浙江大学宁波研究院，浙江 宁波 315100；3.浙江大学馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058）

食品安全问题关系人类生命健康，对于如何降低食品安全风险，不同时期的研究人员有不同的研究策略。传统的热加工容易破坏食品原有风味甚至产生苯并芘等致癌物质，家禽等在养殖过程中使用的抗生素若造成残留则会促进耐药菌的产生，它们对传统热加工有更高的耐受性。现阶段的食品加工处理倾向于最大限度保留食品的风味、营养、色泽，并保证食品微生物安全达标，因此非热加工技术受到了越来越多的关注。

超声波是一种超出人耳听觉范围、频率高于20 kHz的机械波。目前研究中常用超声波可以按频率高低分为：低频超声（也称功率超声，20～100 kHz）、高频超声（100 kHz～10 MHz），其中高频超声包含诊断超声（5～10 MHz）。作为一种新兴的非热加工技术，超声波因其无残留、可自动化、设备相对简单等特点被广泛应用于医学诊断、距离测量、食品加工、材料切割等领域。

研究发现超声波具有一定的杀菌效果，但单独使用的效果有限。而超声波与其他杀菌技术联用的栅栏技术在提高杀菌效果方面有显著的积极作用。杀菌剂具有杀菌谱广、价格低廉等优势，有最广泛的工业应用基础，但杀菌剂也存在易产生有毒副产物、渗透性差等问题。实际上，超声波和杀菌剂的联用具有良好的协同杀菌效果，不仅可以减少杀菌剂的用量从而减少化学残留和有毒有害物质的生成，还可以缩短杀菌处理时间，在实际生产中具有巨大的应用潜力。本文综述超声波空化效应、超声波与杀菌剂联用的杀菌机理和影响因素，以及它们在食品领域的应用，旨在为进一步研究基于超声波与杀菌剂的联用技术提供参考。

1 超声波空化效应

空化阈值即发生超声空化需要的最小声压，当超声波在液体介质中传播时，由于周期性的正负压交替，施加的声压超过空化阈值，液体介质内分子间的吸引力不足以维持分子间距，导致分子之间产生空隙而形成空腔，当空腔中气体足够多时便形成了空化泡，空化泡在振荡过程中经整流扩散逐渐长大，直至临界尺寸时迅速崩溃，该过程即超声空化。空化泡的崩溃有两种类型，即稳态空化和瞬时空化。稳态空化发生在较小的声压条件下，空化泡一般不发生激烈的崩溃，当其非线性振荡较为强烈时，稳态空化泡周围的液体随之运动，伴有强剪切力。瞬时空化一般发生在声压足够大时，瞬时空化泡被压缩至极致，在反弹的过程中发生内爆，形成许多小空化泡，伴有剪切力、冲击波、微射流等物理效应，并产生局部高温（约5 000 K）和高压，生成自由基等高氧化活性物质，引发随后的一系列化学反应，这些作用最终导致细菌失活。

空化效应即气泡成核作用，在声压幅值的负压相超过空化阈值时发生。由于气体溶解度与压力成正比，负压下溶解在液体中的气体达到过饱和状态，不能再溶解，就会产生许多气泡。成核后，空化泡开始生长直至破裂（图1），频率在很大程度上决定了该过程的长短，研究表明空化泡的寿命会随着频率的增加而降低，由213 kHz时的0.35 ms降低到1 062 kHz时的0.10 ms。空化效应作为超声的反应核心，会引起一系列物理化学现象，本文着重介绍超声穿孔、声化学、声致发光现象。

图1 超声空化泡生长周期示意图Fig. 1 Schematic diagram of the growth cycle of ultrasonic cavitation bubbles

1.1 超声穿孔

超声穿孔现象，即超声波产生的机械应力使细胞膜渗透性瞬时可逆地增加形成孔穴的现象。超声穿孔主要与空化泡崩溃前的周期性振荡、崩溃后产生的剪切应力有关（图2）。这些孔的直径从几十纳米到几百纳米不等，小分子可以通过这些瞬时孔被动扩散进出细胞。科学研究已经在形态学上观察到高强度低频的超声波处理细菌会导致孔的形成，低强度高频超声波则没有明显损伤。声穿孔现象在药物递送、食品微生物杀菌等领域研究较多。例如，陈丽娟等利用超声（1 MHz）结合微泡可逆地有限开放脑胶质瘤血脑屏障，对脑组织无明显损伤。杨梅利用高强度聚焦超声诱导小鼠皮肤形成微孔，实现了经皮递送乙肝疫苗。Khadhraoui等研究了超声波提取迷迭香叶片中迷迭香酸的机理，结果表明超声波可能通过包括超声穿孔在内的6 个链解构机制中发挥作用。

图2 超声穿孔示意图Fig. 2 Schematic diagram of sonoporation

1.2 声化学

声化学即由声空化产生自由基并引发一系列次级化学反应的效应。Suslick将声化学广义地分为同质、异质两类，前者涉及键断裂或自由基形成导致的化学反应，后者代表由增强的传质作用而提高化学反应性的声化学效应。自由基产率是声化学效应中的重要部分，尽管单个空化泡中产生的自由基数量与频率呈负相关趋势，但在整个反应体系内的自由基产率是先随频率升高而后再下降的，因为在反应体系内，当频率升高时，空化泡的寿命变短，其内的自由基将迁移至气泡外从而引发产生更多的自由基。除自由基的含量外，过氧化氢、氧气的含量等都会影响声化学效应的强弱，故常用反应分子物质的量与超声波能量的比值来反映声化学效应的强弱，单位为mol/J。

大量研究表明声化学效应在200～300 kHz最强。另外，声化学效应的强弱还取决于空化泡内部温度、空化阈值、空化泡数量、空化泡寿命等因素。一方面，根据气泡动力学，随着声波频率的增加，空化泡崩溃时达到的最高温度下降；空化阈值随频率的增大而增大，使得非均匀声场中产生空化泡的活跃区域变窄，这两个因素导致声化学效应变弱；另一方面，随着超声波频率的增加，波长变短，对应的活跃区间隔也变短，驻波场中的空化泡密度增加；空化泡的寿命在高频率声场中变短，更多自由基可以从空化泡中逸出，与介质中的其他物料发生反应，这两个因素导致声化学效应增强。

1.3 声致发光

声致发光是指超声过程中空化泡破裂瞬间产生高温高压导致的闪光现象。声致发光可以分为单气泡声致发光和多气泡声致发光。前者是由单个稳定振荡的气泡在驻波的波腹处发生的闪光，它源于空化泡坍塌时内部的发射的等离子体；后者是是由液体中的许多空化泡共同产生的闪光，它不仅源于内部等离子体发射，还包括空化泡坍塌时发生的化学发光，但仍存在争议。

声致发光产生的闪光可以催化金属氧化物等声敏剂产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）从而发挥抗菌作用。Zhang Lingling等利用ZnO纳米流体与超声波联用处理大肠杆菌，发现超声波的存在诱导了更多ROS的产生，同时还可以分散聚集的ZnO，促进ZnO粒子产生自由基。较低的频率和较高的功率密度下抑菌效果更好，这可能是由于在这些情况下坍塌的空化泡有更多的势能，而这些势能将促进化学反应的进行以及转化为热、光和声能，进一步催化声敏剂来起到杀菌效果。但若声敏剂的吸收光谱范围与超声波产生的瞬时闪光的光谱范围没有较好重叠，则有可能削弱两者联用的效果，这还有待进一步的研究证明。

2 杀菌剂及其与超声波联用的杀菌机理

超声波与杀菌剂联用时，主要通过以下途径起杀菌作用：一是超声波可以将团聚的细菌细胞簇打散，有助于杀菌剂接近细胞表面而提高杀菌效率，同时，超声波本身的机械剪切、热效应和声化学效应也可以破坏细菌；二是超声波可以提高化学试剂的渗透效率，使化学试剂更易渗透到细胞内部而提高杀菌效率；三是超声波可以通过诱导部分杀菌剂生产更多具有杀菌活性的物质来提升杀菌效率。常见的杀菌剂主要有含氯试剂、过氧化物、季铵化合物（quaternary ammonium compounds，QACs）等，各项联用技术的杀菌机理总结如图3所示，下面具体分小节展开讨论。

图3 超声波联合杀菌剂的杀菌机理Fig. 3 Mechanism of microbial killing by combined treatment of ultrasound with bactericides

2.1 含氯试剂

含氯试剂具有杀菌谱广、生产成本低、应用范围广等特点，常见的含氯试剂有氯气、次氯酸钠、次氯酸钙、二氧化氯、次氯酸以及微酸性电解水等含氯混合物。含氯杀菌剂能穿过细胞壁进入细胞内，同时释放ROS，导致蛋白质侧链氧化和去折叠化，并与核酸发生反应导致氧化损伤。超声波单独使用时，其振动过程产生的机械作用可以促进细菌、生物被膜从果蔬等产品表面脱离，减少产品表面的微生物负载。Tan等使用20 kHz的超声波处理鼠伤寒沙门氏菌60 s，发现在保持细胞活性的前提下，菌体的鞭毛量显著下降至55%，该菌的附着量减少了10%～15%，这可能是因为细菌的鞭毛被破坏后，细菌不足以运动到与基质表面足够近的距离来完成附着。这一发现为超声波联合杀菌剂提升杀菌效果提供了一种潜在可能性，即超声处理可以通过将细菌从待洁净表面转移至含有杀菌剂的液体环境中的方式来提升杀菌效果。

已有研究发现，超声波和含氯试剂联用时存在协同效应。一方面，由于超声波的机械作用和声化学效应，细胞膜的选择透过性被破坏，可能会增强杀菌剂对细菌的渗透作用；另一方面，空化效应也能促进溶液中微生物团簇的分解，增加杀菌剂与微生物的接触。而在这些外界的强刺激下，细胞也可能为“自保”而作出一些积极响应。Yu Hang等研究发现，超声波与二氧化氯联合处理金黄葡萄球菌时，超声波破坏了细胞膜结构，同时也激活了细胞内机械敏感通道（如MscS和MscL），进而促进了二氧化氯进入细胞内，二者共同胁迫引起细胞的辅助基因调节系统（accessory gene regulator，Agr）上调基因，这可能导致金黄色葡萄球菌间的黏连性下降，使得生物被膜更松散；另外，和基因的下调抑制了生物被膜的形成；和基因与细胞裂解的能力密切相关，相比于二氧化氯单独处理，联用处理使基因上调1.82 倍，基因下调1.52 倍，使得金黄色葡萄球菌细胞更容易被裂解。这说明联合处理对细菌细胞结构的影响是多方面的，且对细菌有较好的致死作用。

但是，含氯试剂易与水中杂质反应生成DBPs并危害公共健康，如与水中的含氮化合物（包括氨）反应，生成三卤甲烷等致癌物。另外，超声波有一定的脱气和降解作用，这会导致联用时有效氯含量降低。故现有研究尝试使用其他更安全的杀菌剂来替代含氯化合物。

2.2 过氧化物

过氧化物是一类化学分子结构中包含有过氧基（—O—O—）的强氧化剂，因其强氧化性且杀菌范围广而广泛用于医疗、食品、水处理、水产养殖、家庭防护等。常见的过氧化物杀菌剂有过氧化氢、过氧乙酸、无机过氧酸盐、过碳酰胺、单过氧邻苯二甲酸镁等。过氧化物的氧化作用可以造成细菌膜脂质、蛋白质、核酸等的氧化损伤。另外，其强氧化性的另一部分还可能来自于分解过程中产生的活性衍生物，如自由基。以过氧乙酸为例，其可通过3 种途径产生自由基：一是在酸性环境中过氧乙酸的末端氧发生质子化，脱去一分子水，最终形成带有多余电子的乙酸根离子；二是给出一个电子后形成过氧酰基自由基；三是由外加能量破坏过氧化物或O—H后解离产生自由基。另一种重要的过氧化物，即HO，其与过渡金属铁离子共同参与Fenton反应也可以产生大量自由基。这些自由基可以对蛋白质和酶的巯基（—SH）以及二硫键（—S—S—）起到极强的破坏性作用，从而影响了由激酶、磷酸酶和转录因子控制的细胞内稳态环境。

通常，细菌的抗氧化性由强到弱为细菌芽孢＞革兰氏阳性菌＞革兰氏阴性菌，且细菌存活率随氧化剂浓度或用量的增加而下降。另外，在氧化水平较低的情况下，细菌胞内的过氧化氢酶或其他过氧化物酶的存在会增加细菌对氧化的耐受性。但与超声波联用后，即使氧化剂浓度较低，也可以达到较好的杀菌效果，特别是联用后自由基水平的增加大大提高了杀菌效率。Rubio-Clemente等采用高级氧化工艺（advanced oxidation processes，AOPs），对饮用水中的病原体大肠杆菌进行紫外/HO、紫外/超声和紫外/超声/HO处理，发现紫外/超声/HO体系处理5 min即可使大肠杆菌完全失活（检测限为1 CFU/100 mL）。该研究还发现，超声波联合HO处理的细菌去除率相比于单独超声作用时增加了62.16%，这是因为超声波的空化效应促进了HO热分解产生更多的羟自由基。Giannakis等利用超声波和Fenton反应联合处理废水，单独超声波或Fenton反应处理时细菌数量分别可减少27.9%和24.4%，联合处理使细菌数量减少82.1%，达到两种单独处理下细菌减少量之和的1.57 倍，Giannakis等认为其协同效应是因为HO重组并不断引发新的Fenton反应，同时，超声波使细胞膜的渗透性暂时性地提高，Fe更易进入细菌细胞内，促进Fenton反应产生更多自由基，造成活性物质的氧化损伤，最终导致细菌失活。

2.3 无机金属氧化物

无机金属氧化物因其良好的抗菌性、化学稳定性、低毒性、不使细菌产生耐药性等优势而被广泛研究。无机金属氧化物的杀菌机理研究较多的主要有3 种：一是因静电作用聚集在细胞表面，影响物质交换；二是渗透入细胞内，与胞内含硫蛋白质以及DNA等含磷化合物相互作用，影响细菌的呼吸链、分裂等过程，最终导致死亡；三是通过形成高氧化活性的自由基氧化细菌细胞。在实际研究中，这3 种机理往往同时存在。

近年来，金属氧化物纳米颗粒（nanoparticles，NPs）优良的光催化活性是研究的热点。在光催化下，NPs吸收能量，在导带产生负电子，在价带产生带正电的空穴，自由电子可以攻击周围的氧和水分子，形成ROS，介导细菌死亡。而超声波的声致发光效应可以为NPs提供光催化环境。Zhang Lingling等利用声光催化ZnO纳米流体，发现声光催化可以提高ROS水平，而上清液中锌离子的浓度却没有增加，与此同时，声光催化下大肠杆菌的失活效率提高了约20%，Zhang Lingling等指出声光催化下大肠杆菌失活效率的提高主要是因为ROS水平提高而不是锌离子。Rahman等开发了一种使用Fe/ZnO NPs的可见光辅助声光催化方法对志贺氏菌进行处理，也得到了类似的结论，他们还发现该方法会影响细菌细胞的脂肪酸组成，并减弱细菌形成生物被膜的能力。

目前对NPs和超声波联用的研究处于起步阶段，其杀菌机理研究并不深入，还需进一步研究。

2.4 季铵化合物

QACs，即一个带正电的氮原子与4 个相同或不相同的脂烃基或芳烃基共价连接的化合物，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有杀菌效果，能抑制细菌芽孢的生长但不能抑制其萌发。带正电的氮使QACs容易与细菌表面产生静电吸引而吸附到细胞膜上破坏其电荷分布，同时QACs的长烷基链能渗透细胞膜，与DNA结合，其链长在C～C范围内可达到最佳杀菌效果。但是细菌自身编码的多种外排泵、细胞膜成分的改变等会提高细菌对QACs的耐受性。

超声波与QACs联用常被用于去除生物被膜，联用后既能减少QACs用量，又能保持一定的生物被膜清除能力。单核细胞增生李斯特氏菌（以下简称单增李斯特菌）是一种易在与食品接触的塑料、钢材等表面形成生物被膜的常见菌。Torlak等联合超声波与苯扎氯铵处理聚苯乙烯表面的单增李斯特菌生物被膜，结果发现联合处理1 min的杀菌效果优于相同浓度下苯扎氯铵单独处理5 min的效果，说明联合处理可以减少杀菌所需时间；同时，Torlak等还发现在处理5 min条件下，联合超声波与100 mg/L苯扎氯铵的杀菌效果优于单独使用400 mg/L苯扎氯铵的杀菌效果，说明联合处理可以降低苯扎氯铵的使用量。Torlak等推测两者的协同效应可能是超声波提高了传质效率，促进了苯扎氯铵向生物被膜的传输，破坏了细菌细胞膜脂质双层，通过解离导致细胞质泄漏，最终清除生物被膜。Berrang等也得到了相似的结果。

2.5 酸

酸作为广谱杀菌剂在生产生活中应用广泛，其中大多为有机酸。有机酸以非解离的形式进入细菌细胞内并解离，产生的阴离子和质子促使细胞排出过多的质子，该过程消耗了维持胞内pH值稳态的能量，最终导致细胞死亡。当pH值相同时，无机酸的解离常数高于有机酸，无机酸完全解离，在胞外对细菌影响相对较小，而有机酸未解离，可以进入细胞内发挥作用，因此pH值越低，未解离形式的酸所占比例越高，抗菌效果也就越好。

据报道，超声波联合乳酸、柠檬酸或苹果酸处理生菜叶片，可使单增李斯特菌和大肠杆菌对数值减少约2.5（lg（CFU/g）），比单一有机酸处理额外减少0.8～1.0（lg（CFU/g））。联合处理提升杀菌效果的原因可能是超声空化效应将细菌从生菜叶上剥离下来，增加了有机酸与生菜叶褶皱内细菌的接触，提升了酸的作用效率。

2.6 精油

精油作为从芳香植物中提取的天然抗菌剂，具有显著的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗寄生虫活性。精油可以抑制细菌胞外多糖和蛋白的分泌、调节基因的转录水平来抑制生物被膜的形成、干扰膜电位、阴碍DNA合成，抑制多种酶系统，影响细菌糖代谢途径。

超声波处理可减小精油液滴尺寸，增大液滴的比表面积，增加液滴与微生物的接触面积，从而达到协同杀菌效果。精油也可在细菌细胞的磷脂双分子层中堆积，使其对超声波更敏感。另外，为了改善精油的水不溶性、提高化学稳定性和生物利用度，研究人员常将其制成乳液。He Qiao等联合超声波（3.33 W/mL）与百里香精油纳米乳液处理金黄色葡萄球菌3 min，与两者单独处理的加和相比，杀菌量对数值显著增加了1.44（lg（CFU/mL）），He Qiao等认为协同效应产生的原因可能是超声波处理使细菌细胞膜损伤导致表面疏水性降低，进一步提高了精油乳液与细菌的互作机率，两者的联用使得胞内物质大量流失、细胞膜失去膜电位、膜成分变性最终导致细菌死亡。

2.7 气体

一些气体如臭氧、二氧化碳、二氧化氯等溶于液体介质中可用于杀菌，它们都作用于细胞膜和细胞质，但在具体作用机理上有所差别。臭氧具有较高的氧化电位（2.07 eV），经链衰减可以产生羟自由基和ROS，主要攻击细胞壁上的脂质、蛋白、酶以及胞内的酶和核酸，但关于臭氧分子与自由基在杀菌机制中哪一种为主要途径并不明确。高压二氧化碳作为“一般认为安全”、环境友好的新型杀菌技术，具有无毒、价格低廉、易于获取的优点。二氧化碳可以通过降低胞内外pH值、改变细胞膜流动性、影响酶促反应等方式提高杀菌效率。二氧化氯也是一种强氧化性气体，作为氯气的有效替代物，其活性为氯气的2.5 倍，可通过改变细胞膜透性造成胞内物质外流导致细菌死亡，且不产生致癌物。

超声波与气体杀菌剂联用产生协同效果的原因主要为超声波促进了气体与细菌的接触或对细菌细胞的渗透。Yu Hang等采用超声波（20 kHz、60 W）和质量浓度1、4 mg/L的二氧化氯联合处理金黄色葡萄球菌生物被膜时均产生了明显的协同效果，Yu Hang等认为一方面超声波促进了二氧化氯对细菌的渗透作用；另一方面超声波促进了二氧化氯气体的均匀分布，为空化泡提供了更多成核位点，有利于局部升压和热点的产生。而超临界二氧化碳与超声波联用时，超声波的机械搅拌作用提高了二氧化碳的溶解度，导致细胞内pH值下降加快，从而加速细菌失活最终导致死亡。

3 超声波联合杀菌剂对杀菌效果的影响因素

3.1 杀菌剂的种类

杀菌剂种类不同，其杀菌机理也存在差异，故在超声波与不同种类杀菌剂联用时效果也有差异。Šístková等发现在5 种化学试剂和低频超声波处理朝井杆菌属（）生物被膜的过程中，以过氧乙酸为主要成分的复配试剂单独使用时效果最好，而联用时，以二氧化氯为主要成分的复配试剂和超声波显示出更好的清除效果。Palanisamy等发现过氧化氢与超声波的联用效果优于氢氧化钠与超声波的联用效果。

3.2 超声参数

超声参数主要包括超声频率、超声功率（或振幅）、作用时长。目前应用最多的超声频率为20 kHz，因为研究发现，在功率超声条件下（频率20～100 kHz、功率10～1000 W/cm），超声波产生的剪切力等机械作用对细菌细胞有很强的破坏效果。一方面，功率超声在传播过程中会引起液体介质激烈振荡；另一方面，功率超声的空化效应会产生剪切力、冲击波、微射流、湍流等机械作用，都会破坏细菌细胞。当超声频率一定时，超声波对细菌的破坏效果随功率增加、作用时间延长呈现增强的趋势。如迟媛等联合超声波和次氯酸钠处理腐败菌，致死率随着超声功率、处理时长的增加而提高，且高功率下的联合处理有显著的协同杀菌效果，这可能是由于在一定范围内超声强度的增加增强了空化效应，提高了对细菌外层结构的破坏强度，促进次氯酸钠直接作用于细菌而加速细菌死亡。可见，空化效应强度受超声参数调节，对杀菌效率有重要影响，较好的杀菌效果需在施加声压高于空化阈值且空化效应较强时实现。许多研究表明，低频超声发生空化效应所需的空化阈值低于高频超声，低频超声条件下的杀菌效果也往往优于高频超声。

3.3 细菌的特性

杀菌效果不仅取决于外界胁迫，还取决于细菌的特性，包括细胞形态和大小、基因型、细胞浓度、生长周期、膜结构等。研究发现，芽孢比营养细胞、革兰氏阳性细菌比革兰氏阴性细菌、球状细菌比杆状细菌对外界环境刺激有更高的抗性。其中，芽孢有多层致密结构，具有较强的抗逆性，能在多种极端条件刺激下维持活性。革兰氏阳性菌的细胞壁有一层较厚（20～80 nm）的肽聚糖层，不利于通过直接接触方式起作用的杀菌技术发挥效果。革兰氏阴性菌则有脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和磷脂提供机械强度。不同大小的细菌对联合处理有不同的耐受程度，如相比于常见的大肠杆菌，细胞更小的缺陷短波单胞菌（）对超声波联用超临界二氧化碳处理的耐受性更低。通常不同尺寸的细菌耐受性也不同，尺寸大的细菌往往比尺寸小的细菌对超声波更敏感，这可能是因为前者具有更大的表面积，因此受到更多的超声作用。

杀菌效果还受细菌胞内信号传导系统响应的影响。如在微气泡存在下，低频超声与阳离子抗菌肽人β防御素联用处理耐抗生素葡萄球菌，控制葡萄球菌生物被膜形成的基因表达提高，基因和基因表达被抑制，导致耐抗生素葡萄球菌生物被膜形成能力下降，抑菌效果提高。另外，细菌包膜应激响应（bacterial envelope stress responses，ESRs）系统也可影响杀菌效果。在革兰氏阴性菌中定义了5 种ESRs，分别是（sigma factor）、Cpx（conjugative pilus expression）、Bae（bacterial adaptive respons）、Psp（phage shock protein）、Rcs（regulator of capsule synthesis）响应系统。然而，关于联用后细菌基因水平变化的研究较少，仍需进一步探索从分子水平揭示联用技术具有协同效果、无明显作用或导致拮抗作用的机理，以及细胞的响应通路，为解决微生物安全问题提供更多参考。

3.4 介质的特性

液体介质通常为含水体系，超声波的空化效应可引起水分子裂解，并借由液体的振动传播能量，该过程中介质温度上升，而温度的变化可能会影响细菌细胞膜的状态；杀菌剂则需以液体介质作为媒介接触细菌达到杀菌效果，故介质的黏度、固形物含量、温度等均会影响杀菌效果。介质黏度是表示流体流动时阴力大小的指标，当液体黏度高时，其传质效率低，杀菌难度提高，效果变差。对于超声空化而言，其强度受介质黏度影响，产生空化泡需要克服介质分子间力，若介质黏性较大，则难以产生空化。介质中含有的固形物除了有提高介质黏度不利于超声波传播外的特性外，细菌也可附着在大而粗糙的固形物表面，如果蔬的表面缝隙、与食品直接接触的粗糙钢材表面，更“隐蔽”的同时还能形成生物膜，降低杀菌剂与细菌的接触概率及超声波的作用效果。另外，介质中的固体微粒也可以为超声波提供成核位点，提高空化活性，增强杀菌效果。研究发现，牛乳中含有的乳糖有助于细菌合成渗透保护剂或通过结合自身的游离羟基与细菌细胞磷脂层的极性头部而提高抗性。介质的酸碱性也会影响超声波联合杀菌剂的杀菌效果。当介质中酸性较强时，杀菌效率更高，如de Freitas等使用145.54 μmol/L乳酸链球菌素联合超声波处理志贺氏菌15 min，结果发现在pH 4.5时的杀菌效率高于在pH 6.5时的杀菌效率，这可能是低pH值影响了细菌细胞的稳定性。另外，介质内含物还可以作为细菌损伤后的修复材料，包括已经死亡的个体也可以为活细胞提供养分，如Yamamoto等的研究表明在不添加营养物的条件下，大肠杆菌菌液（含10CFU/mL死菌和10CFU/mL活菌）25 ℃下1 d内活菌数可恢复至10～10CFU/mL，Yamamoto等认为这是因为活细胞吸收了死细胞。

4 超声波联合杀菌剂在食品工业中的应用

超声波联合杀菌剂在果蔬表面清洗、肉制品保鲜、乳制品杀菌等方面均有应用，表1整理了部分研究。在果蔬加工中，两者联用可有效去除农药残留，抑制多酚氧化酶、过氧化物酶和细胞壁降解酶的活性，稳定细胞壁多糖，并除去表面微生物来减缓腐烂。Bal等用水杨酸（1 mmol/L）、超声波（32 kHz）以及超声波与水杨酸联合处理甜樱桃果实（10 min），贮藏40 d后腐烂率分别为13.5%、10.8%、3.8%，而对照组腐败率高达24.4%。Mustapha等将超声波分别与二氯异氰尿酸钠、过氧乙酸、过氧乙酸、过氧化氢联用，其中40 mg/L过氧乙酸、5%过氧化氢及超声波联用可使樱桃番茄表面微生物对数值减少3.07～3.10（lg（CFU/g））。同样地，超声波与杀菌剂也可用于肉类表面除菌，同时，超声波还可以起到肉嫩化的作用。乳制品中牛奶常被作为研究对象，微生物可以附着在脂肪球上而增加杀菌难度，联合技术可以有效灭活牛奶中的微生物群。如Shamila-Syuhada等将5 种腐败菌、致病菌接种至牛奶中（初始菌量约为8.1（lg（CFU/mL））），采用超声波（24 kHz、125 μm振幅）和过氧化氢（质量分数0.01%）联用处理10 min即可杀灭接种菌，最大程度维持牛奶品质。食品加工过程中涉及许多塑料管道、不锈钢器材等，对这些表面的清洁也是食品质量安全控制的重要一环。Yu Hang等联合超声波（20 kHz、60 W）和二氧化氯（4 mg/L）用于清除4 种与食品直接接触材料表面的金黄色葡萄球菌生物被膜，处理10 min后金黄色葡萄球菌失活率为99.03%，体现出协同效果（单独超声波处理为15.86%，单独二氧化氯处理为82.62%），Yu Hang等发现联合处理通过介导群体感应信号分子、细胞间黏附和多糖细胞间黏附素产生减少了生物被膜的形成，肠毒素的分泌也被抑制，且接触材料表面越粗糙，联合处理的生物被膜清除率越低。

表1 超声波联合杀菌剂杀菌的研究Table 1 Selected studies of microbial killing by combined treatment of ultrasound with bactericides

5 结 语

超声波作为一项有潜力的非热加工技术，具有绿色、无污染的特点，但在单独使用时杀菌效果不理想，需要提高处理强度来弥补，高强度超声下大量能量以热能形式耗散造成浪费，也会缩短仪器寿命；杀菌剂应用广泛，但也存在单独使用渗透性不高、浓度高易产生有毒副产物等问题，而杀菌剂联合超声波进行杀菌处理，往往可以达到协同杀菌效果，既可以解决单独超声波杀菌效果不佳的问题，还可以弥补杀菌剂的不足。联合杀菌技术目前虽已在果蔬表面清洗、肉制品保鲜、乳制品杀菌方面有一定的应用，但是由于其提高了体系的复杂程度，目前对协同杀菌机理的研究并不深入，导致其应用受限，在今后的研究中可以下列工作为重点：1）明确微生物的应急响应机制，结合基因组学、转录组学、蛋白组学等多组学对联合技术影响微生物的分子机制进行整合分析；2）明确超声波空化效应的动力学，优化超声波空化参数，实现空化程度精确调控，既可以明确在杀菌效果中空化效应所占比重，又可以为实现工业化生产提供技术参考；3）确定通用的基础细菌模型、统一的关键杀菌技术参数，使各项研究结果之间能够互相比较，并整合结果建立数据库，为创建新的杀菌模型提供数据支持；4）开展在食品基质中的实际应用实验，明确联合技术与食品基质之间的相互作用关系，为工业化应用提供依据。