山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏幼鼠肠道功能的影响

刘 飞，郝婧宇，赵子夫，司徒文佑,3，段素芳,3,*，霍贵成，哈 惠

（1.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.内蒙古乳业技术研究院有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010110；3.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，伊利母婴营养研究院，北京 100022）

联合国儿童基金会在《2019年世界儿童状况》报告中提出，目前在全球出现的儿童营养不良主要有3 大形态：营养不足、隐性饥饿和超重。全球超过7亿的5 岁以下儿童中约1/3正处于营养不足或超重状态，至少半数因维生素和其他必需营养素的摄入不足而遭受隐性饥饿的困扰。营养不良主要由低质量的儿童膳食引起，约2/3的儿童日常饮食未达到保障健康生长发育膳食多样性的最低推荐。因此，用微量营养素强化辅助食品与主粮可作为一项对抗儿童、年轻人与妇女隐性饥饿的有效干预措施。

中国儿童隐性饥饿的营养不良问题普遍存在，与食欲和能量代谢密切相关的维生素如VB、VB、VB和VA，中国4～13 岁儿童的摄入不足率分别约为27%、78%、77%和48%，维生素的缺乏易导致食欲低下、消化不良或中医概念上的脾虚症状。山楂具有健脾开胃、消食化滞的功效，山楂中的有机酸是消食导滞的主要活性成分。麦芽也具有消食、健脾和开胃的助消化作用。《中华人民共和国药典（2020年版）》中规定，当用于行气消食、健脾开胃即促进消化时，山楂用量为9～12 g、麦芽用量为10～15 g。目前许多研究结果表明膳食纤维具有多种生理保健功能，与人体健康密切相关，可通过改善肠道菌群结构及代谢间接调控肠胃功能。缺乏膳食纤维会引发多种疾病，如大肠炎、结直肠癌、过敏、自身免疫疾病及肥胖，膳食纤维过量又会影响身体健康。我国成人（19～50 岁）膳食纤维建议摄入量为25～30 g/d，14 岁以下儿童按照10 g/4 185.85 kJ计算，学龄前期儿童膳食纤维适宜摄入量为12～14 g/d。低聚木糖和聚葡萄糖都属于水溶性膳食纤维，可以很方便地被添加到多种食品中，其在小肠中不能被消化或吸收，几乎完好无损地到达结肠并在大肠中被发酵，导致粪便变软且体积增加，同时促进肠道运动，缩短肠道内容物通过肠道的时间。低聚木糖和聚葡萄糖在宿主大肠内的发酵可优化肠道菌群结构，导致有益菌群丰度增加、腐败菌群减少和短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）产量增加。研究发现，进食0.7 g/d低聚木糖3 周后肠内双歧杆菌相对丰度可由8.5%增至20.2%，若进食剂量增加至1.4 g/d，则双歧杆菌相对丰度可由9.3%增至37.4%。低聚木糖和聚葡萄糖还能够改善宿主肠道组织形态，增加小肠绒毛高度，提高小肠绒毛高度与隐窝深度比值，从而有助于宿主营养物质的吸收，促进肠道健康。有研究表明健康成人进食4～12 g/d聚葡萄糖28 d后，肠道内SCFA含量、乳杆菌属和双歧杆菌属丰度会增加，同时能改进肠道功能。

针对儿童微量营养成分隐性饥饿问题，有必要评估某些具有健脾功效的药食成分及膳食纤维对机体肠道功能的调控作用。目前，鲜有山楂和麦芽对维生素缺乏幼鼠肠蠕动性的影响，及山楂、麦芽和低聚糖复合物通过调控维生素缺乏宿主肠道微生态的平衡来改善其肠道吸收功能的相关报道。因此，本研究以断奶鼠为模型动物，旨在评估在维生素缺乏状态下，山楂、麦芽及其与低聚糖复合物对断奶鼠肠道功能的作用，重点研究各种受试物组合干预对幼鼠生长性能、肠道组织形态和吸收功能、粪便中关键微生物组成和SCFA含量的影响，为新型功能食品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

3 周断奶SPF级雄性ICR小鼠（合格证编号1100111911061447，体质量12～14 g）、3 周断奶SPF级雄性SD大鼠（合格证编号1100111911061449，体质量40～60 g）均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。本研究中动物实验方案由东北农业大学实验动物伦理委员会批准（NEAU20200113）。

山楂粉 黄山华绿园生物科技有限公司；AIN-93G纯合饲料、特配饲料 南通特洛菲饲料有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸 德国Sigma公司；麦芽粉 上海金山德乐食品配料有限公司；低聚木糖、聚葡萄糖 山东百龙创园生物科技股份有限公司；复方地芬诺酯 河南鼎昌药业有限公司。

1.2 仪器与设备

7890气相色谱仪、5977B质谱仪、DB-FFAP色谱柱（15 m×250 μm，0.25 μm） 美国Agilent公司；E600光学倒置显微镜 日本尼康公司；680型酶标仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组与饲养

参考《保健食品功能评价方法（2020年版）（征求意见稿）》中“十六、有助于消化功能检验方法”中的要求采用小鼠进行小肠运动实验，其余指标的检测均采用大鼠进行实验。

各处理组干预物的添加量按照检验方法中的要求，“以人体推荐量（折算为每千克体质量的剂量）的10 倍（小鼠）或5 倍（大鼠）为其中的一个剂量组”。根据药典中的推荐量确定本实验中体质量70 kg成人山楂和麦芽的低剂量组使用量均为10 g/d。《中国营养科学全书》中推荐的学龄前儿童每日膳食纤维摄入量为12～14 g/d，同时食物中营养素的添加量一般以膳食营养素推荐摄入量的1/3～1/2为宜，因此确定本实验中膳食纤维的总用量为4 g，然后根据文献进一步确定低剂量组低聚木糖和聚葡萄糖的使用量分别为0.7 g/d和3.3 g/d。根据文献[16]可知，4～5 岁儿童的体质量中位数为19 kg，由此分别计算出低剂量组中低聚木糖和聚葡萄糖的添加量。基于应用特性考虑，确定高剂量组山楂和麦芽的添加量为低剂量组的5 倍。为研究添加超过每日推荐剂量的膳食纤维是否能够进一步改善肠道功能，将高剂量组低聚木糖和聚葡萄糖添加量增加至低剂量组的4 倍，该剂量接近低聚木糖和聚葡萄糖批准使用剂量上限。

所有动物饲养于屏障系统动物房中，温度22 ℃，相对湿度10%～60%，光照周期为12 h。60 只3 周断奶大鼠自由采食，自由饮水，AIN-93G纯合日粮适应性喂养1 周后，按照体质量随机分成6 组，每组10 只大鼠，每2 只养于一笼，正式实验期为5 周，具体处理及分组见表1。称量大鼠初始体质量、实验结束时空腹体质量，计算整个实验结束时大鼠的体质量增量，记录摄食量，观察鼠状态，食物利用率计算如式（1）所示。

表1 大鼠、小鼠实验处理与分组Table 1 Feeding and grouping of experimental rats and mice

采取特配饲料喂饲方式给予实验动物干预物。根据以往经验，以每周末大鼠和小鼠的体质量及摄食量作为依据，计算饲料中干预物添加量，分别配制整个周期大鼠和小鼠所用饲料。采用GB 5009.84—2016《食品安全国家标准 食品中维生素B的测定》、GB 5009.85—2016《食品安全国家标准 食品中维生素B的测定》、GB 5009.154—2016《食品安全国家标准 食品中维生素B的测定》和GB 5009.82—2016《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定》中的第一法分别检测山楂和麦芽中VB、VB、VB含量和VA含量，结果表明本实验所采用山楂中不含VB、VB、VB和VA，麦芽中VB、VB、VB含量和VA含量分别为2.92、2.68、9.76 mg/kg和0 mg/kg。按照大鼠最高剂量添加组（3.5 g/（kg·d））计算，山楂和麦芽中VB、VB含量和VB含量分别仅占K组和M组相应维生素含量差值的0.3%、0.2%和0.6%，因此干预物山楂和麦芽中残留的维生素对维生素缺乏模型幼鼠的影响可以忽略不计。

1.3.2 小鼠肠运动实验

70 只3 周断奶小鼠饲养条件同大鼠，纯合日粮适应性喂养1 周后，将其随机分成7 组（每组10 只，5 只一笼），进入为期4 周的正式实验，具体处理及分组见表1。第29天进行肠运动实验检测，实验开始前小鼠禁食16 h，自由饮水。检测当天各组正常灌胃，灌胃30 min后K组灌胃同体积蒸馏水，其余各组均灌胃复方地芬诺酯（质量分数0.025%）。灌胃复方地芬诺酯30 min后，各组灌胃墨汁（含质量分数5%活性炭粉、质量分数10%阿拉伯树胶），25 min后颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔，剪取幽门至回盲部的肠管。将小肠拉成直线，测量肠管长度作为小肠总长度，从幽门至炭末前沿的距离作为墨汁推进长度，按式（2）计算墨汁推进率。

1.3.3 大鼠粪便收集和剖检取样

大鼠干预实验进行34 d后，采集所有大鼠粪便，装于无菌冻存管中，液氮速冻后在-80 ℃冰箱保存，用于后续SCFA含量（乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸）和肠道菌群高通量测序分析。随后禁食24 h，自由饮水，采用乙醚麻醉后断颈处死大鼠，使用体积分数75%乙醇溶液擦拭大鼠腹部，使用消毒后的手术剪打开大鼠腹腔，迅速分离空肠、回肠用于组织形态学观察。

1.3.4 大鼠肠道组织形态学指标观察

取空肠及回肠各1 cm浸泡于质量分数4%多聚甲醛中，随后进行石蜡包埋和制备切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE)染色后采用软件Image-Pro Plus 6.0进行形态观察，比较不同处理组大鼠小肠组织的形态差异，包括肠绒毛高度、黏膜隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度（villus height/crypt depth，V/C）值、肠绒毛光滑度和排列整齐度。

1.3.5 大鼠粪便中SCFA含量的测定

参照本实验室前期研究方法，利用气相色谱-质谱法，通过内标法分析样品中SCFA含量。采用安捷伦DB-FFAP毛细管柱（15 m×250 μm，0.25 μm），进样量1 μL，分流比5∶1；载气氦气，隔垫吹扫流速3 mL/min，柱流速1 mL/min。柱箱升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min；以10 ℃/min的速率升至180 ℃，保持1 min；然后以20 ℃/min的速率升至240 ℃，保持5 min。前进样口温度、传输线温度、离子源和四极杆的温度分别为240、240、230 ℃和150 ℃。电离电压-70 eV，在溶剂延迟2.5 min后，以扫描/模拟模式获得质量范围为/33～150的质谱数据。

1.3.6 大鼠肠道菌群分析

大鼠粪便送至深圳华大基因股份有限公司，采用Illumina MiSeq测序平台，通过检测肠道菌群16S rRNA V3～V4高变区域基因序列分析大鼠肠道菌群结构。获得原始测序数据后，首先进行序列过滤和拼接，得到有效数据，使用USEARCH软件进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，从同一OTU中挑选出丰度最高的一条序列作为OTU代表序列。应用QIIME软件将该代表序列与Silva 132数据库进行比对，获得物种注释信息，并进行Alpha多样性分析，获得样品内物种丰富度和均匀度信息。利用LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析对分组样品的物种组成进行差异显著性检验，随后采用PICRUSt软件预测微生物功能，并利用STAMP软件比较组间的功能差异。

1.4 数据统计和分析

除特别注明外，实验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计学分析，首先对数据进行正态性检验，符合正态分布的数据采用单因素方差分析比较差异性，数据先进行方差齐次检验，方差齐时采用Duncan’s法对数据进行多重比较分析，方差不齐时采用Games-Howell进行数据之间的比较分析；对于不符合正态分布的数据采用Kruskal-Wallis秩和检验；＜0.05为差异显著。采用Origin 8.5软件和R语言绘制图表。

2 结果与分析

2.1 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏幼鼠状态的影响

实验过程中，T4组大、小鼠均有多只动物出现稀便、软便及脱毛症状，其中小鼠在干预第2天即出现稀便，在第18天全部恢复正常。大鼠在干预第8天出现软便症状，干预第29天稀便和软便大鼠数开始增多，至第35天10 只大鼠均出现稀便和软便症状，4 只大鼠耳后脱毛。其余各处理组无上述症状。粪便状态可反映动物的消化功能，稀便和软便症状可能是由于维生素缺乏导致大鼠食欲低下，消化不良。徐瑶研究发现，食积模型大鼠会出现皮毛无光泽、大便色黄黏腻不成形的现象。而脱毛症状的出现表明摄入过量的低聚糖可能加剧了维生素缺乏的症状。

2.2 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠体质量的影响

如图1所示，所有处理组大鼠初始体质量均为90～100 g，无显著差异（＞0.05），经5 周4 种促进消化干预物饲喂实验后，K、M、T1、T2、T3组和T4组大鼠的最终体质量均值分别为368.62、275.91、282.10、301.93、292.72 g和291.16 g，体质量增量均值分别为270.68、177.86、184.30、204.13、195.63 g和193.25 g。所有饲喂维生素缺乏饲料处理组大鼠的最终体质量和体质量增量均显著低于饲喂维生素含量正常饲料的K组（＜0.05）。与K组相比，M组大鼠的体质量增量降低了34.29%。与M组相比，T2处理组大鼠的体质量增量增加了14.77%，显著提高了大鼠的体质量增量（＜0.05）。结果表明维生素缺乏会显著延缓成长期动物的生长发育，导致体质量降低，而饲喂高剂量山楂和麦芽能够显著缓解维生素缺乏引起的体质量降低。山楂中的有机酸主要包括柠檬酸和苹果酸等水溶性有机酸，具有助消化、健胃消食的作用，本研究采用的山楂粉中有机酸（以柠檬酸计）相对含量为6.4%。麦芽有消食行气、健脾开胃的功效，是临床上常见的一味消食药。徐瑶研究发现山楂和麦芽具有改善食积症状的功能，能够促进食积模型大鼠的体质量增长。因此，T2组大鼠的体质量增量显著增加，可能是由于山楂和麦芽的促消化作用缓解了维生素缺乏对大鼠生长发育的抑制作用。

图1 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠体质量的影响Fig. 1 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on body mass in vitamin-deficient rats

2.3 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠摄食量和食物利用率的影响

如图2所示，K组大鼠摄食量显著高于所有其他处理组（＜0.05），维生素缺乏会显著降低大鼠摄食量，其中M组大鼠摄食量较K组降低了17.78%，T2组大鼠饲喂高剂量山楂和麦芽能够提高摄食量，与M组相比提高了7.84%。在自由采食等能量日粮情况下，摄食量反映了动物的食欲和健康状况。消化不良会导致食欲减退、摄食量减少，进而使体质量减轻，反之亦然。T2组大鼠摄食量和体质量增量与M组相比均显著增加（＜0.05），说明高剂量山楂和麦芽具有改善维生素缺乏大鼠食欲的作用。然而高剂量4 种复合物对维生素缺乏大鼠的摄食量和体质量增量没有显著改善作用，结合T4组大鼠排稀便和脱毛现象分析，这可能是由于在摄入高剂量山楂和麦芽的同时摄入过多的膳食纤维，导致大鼠肠道微生物多样性降低，破坏肠道菌群平衡，从而影响肠道吸收功能。

图2 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠摄食量的影响Fig. 2 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on food intake in vitamin-deficient rats

食物利用率可判断动物体质量降低是由于进食减少，还是受试物的影响。由图3可知，维生素缺乏会显著降低大鼠的食物利用率（＜0.05），与K组相比，M组大鼠食物利用率降低了19.24%。T3组大鼠较M组的食物利用率显著增加了11.58%（＜0.05），但仍显著低于饲喂正常饲料的K组（＜0.05），这可能是由于低剂量的低聚木糖改善了肠道组织形态结构，促进了营养物质吸收，从而提高了食物利用率。

图3 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠食物利用率的影响Fig. 3 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on feed utilization rate in vitamin-deficient rats

2.4 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏小鼠小肠肠道运动性的影响

由图4可知，与M组相比，T1组和T3组维生素缺乏小鼠的肠道运动性没有显著变化（＞0.05），T2组和T4组维生素缺乏小鼠的墨汁推进率显著提高了39.04%和21.10%（＜0.05）。T5组应用复方地芬诺酯人为减慢小鼠的肠运动性，复方地芬诺酯能够通过抑制肠道黏膜感受器，消除局部黏膜的蠕动反射，从而减弱肠道平滑肌的蠕动，导致肠道内容物与肠黏膜接触时间变长，肠道内容物中的水分进一步被吸收而使粪便干燥，常被用于便秘小鼠模型的造模。因此，根据实验结果可知，T2组和T4组干预物都能够提高维生素缺乏小鼠肠道的运动性，与K组相比，T2组小鼠的墨汁推进率显著增加17.77%（＜0.05）。温小萍等研究表明，山楂水提物对大鼠胃、肠平滑肌的收缩具有显著的刺激作用，且呈显著剂量依赖性；雷静等也发现中、高剂量的山楂水提取物使小鼠小肠推进率分别显著提高了26.88%（＜0.05）和28.00%（＜0.01），这与本研究结果一致。

图4 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏小鼠肠道运动性的影响Fig. 4 Effect of hawthorn, malt and dietary fibers on intestinal motility in vitamin-deficient mice

2.5 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠肠道消化吸收能力和组织形态学的影响

绒毛和隐窝是衡量小肠消化吸收的重要指标。绒毛高度影响小肠吸收面积，绒毛高度越高，营养物质的吸收越好。隐窝深度反映细胞的生成率，隐窝越浅说明细胞成熟率越高，吸收能力越强。V/C值则综合反映小肠的功能状态，比值下降，表示消化吸收功能下降，常伴随腹泻的发生；比值上升，则表示消化吸收能力增强，腹泻率下降。由图5可知，虽然维生素缺乏对大鼠小肠隐窝深度没有影响，但是会显著降低空肠和回肠绒毛高度以及V/C值（＜0.05），其中空肠和回肠绒毛高度分别较K组降低了25.54%和38.52%，空肠和回肠V/C值分别较K组降低了37.30%和36.79%。而干预物会不同程度缓解维生素缺乏对空肠和回肠的不良影响，提高维生素缺乏大鼠的消化吸收功能。与M组相比，除T1组维生素缺乏大鼠的空肠绒毛高度没有显著变化外（＞0.05），其他处理组维生素缺乏大鼠的空肠绒毛高度均显著增加（＜0.05），其中T2、T3组和T4组大鼠空肠绒毛高度分别增加了24.57%、39.04%和38.52%。与M组相比，T1组维生素缺乏大鼠的空肠隐窝深度显著降低了28.72%（＜0.05），虽然其余干预物处理对大鼠空肠隐窝深度没有显著影响（＞0.05），但是最终所有干预物处理均显著提高了大鼠空肠V/C值（＜0.05），与M组相比，T1、T2、T3组和T4组分别提高了65.42%、52.65%、47.35%和43.61%，从而改善了维生素缺乏大鼠的小肠吸收功能。所有干预物处理组的回肠绒毛高度均较M组维生素缺乏大鼠显著提高（＜0.05），其中T1、T2、T3、T4组回肠绒毛高度分别增加了35.93%、51.34%、50.25%和57.55%；同时，各处理组回肠隐窝深度较M组分别显著增加了24.17%、28.05%、28.43%和34.97%（＜0.05）。郜航研究发现低聚木糖能够显著提高生长期小鼠的小肠绒毛高度，降低小肠隐窝深度，从而提高小肠V/C值，说明低聚木糖增加了肠道吸收表面积，从而改善了小肠的消化吸收功能。而本研究中低聚木糖处理显著增加小肠绒毛高度的同时并没有显著降低隐窝深度，但是低聚木糖显著增加了空肠V/C值，从而改善了维生素缺乏大鼠的肠道消化吸收功能。

图5 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠小肠绒毛高度（A）、隐窝深度（B）和V/C值（C）的影响Fig. 5 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on villus height (A),crypt depth (B) and villus height to crypt depth ratio (C) of jejunum and ileum in vitamin-deficient rats

由图6、7可知，维生素缺乏会显著降低小肠绒毛结构的完整性、表面光滑度和排列整齐度。饲喂高剂量山楂和麦芽能明显改善维生素缺乏大鼠空肠和回肠绒毛结构的完整性，饲喂高剂量4 种复合物能明显改善维生素缺乏大鼠空肠绒毛的表面光滑度，饲喂低剂量4 种复合物处理能明显改善维生素缺乏大鼠回肠绒毛的排列整齐度。

图6 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠空肠组织形态的影响（40×）Fig. 6 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on jejunal morphology of vitamin-deficient rats (40 ×)

图7 山楂、麦芽及膳食纤维对大鼠回肠组织形态的影响（40×）Fig. 7 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on ileal morphology of vitamin-deficient rats (40 ×)

2.6 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠粪便中SCFA含量的影响

如表2所示，与K组相比，M组大鼠粪便中总SCFA含量显著降低了43.87%（＜0.05），不同干预物处理对维生素缺乏状态大鼠粪便中总SCFA含量影响各异；与M组比，T2组和T3组的总SCFA含量分别显著提高了78.00%和44.91%（＜0.05），且与K组没有显著差异（＞0.05），特别是T2组与K组总SCFA含量几乎相同。然而T4组总SCFA含量与M组相比降低了4.93%。膳食纤维的种类和添加剂量对后肠碳水化合物发酵功能有显著影响，低聚木糖和聚葡萄糖在宿主大肠内的发酵可导致SCFA产量增加。有研究表明，健康成年人进食4～12 g/d聚葡萄糖，粪便中总SCFA含量会呈剂量依赖性升高。然而，本研究中膳食纤维摄入过量不能增加维生素缺乏大鼠粪便中的总SCFA含量，反而会导致大鼠肠道菌群失调，这也与T4组大鼠在实验期间的频繁软便和稀便的生理反应相吻合。膳食纤维经肠道菌群发酵后的主要代谢产物是SCFA，主要包括乙酸、丙酸、丁酸以及少量的异丁酸、戊酸、异戊酸。SCFA对宿主代谢、肠道稳态、肠道屏障功能、胆固醇水平等均具有重要调节作用，其中乙酸、丙酸和丁酸是后肠最重要的SCFA，含量占总SCFA 80%以上，这3 种SCFA的含量比例会随着宿主后肠菌群结构和摄入的膳食纤维种类的不同而发生变化。本研究中与K组相比，M组大鼠粪便中乙酸含量显著降低了37.63%（＜0.05），丙酸和丁酸含量没有显著变化（＞0.05）。与M组相比，T2组和T3组大鼠粪便中乙酸含量分别显著提高了46.86%和43.74%（＜0.05）；同时T2组丁酸含量与M组相比显著提高103.58%（＜0.05），甚至高于K组，但差异不显著（＞0.05）。李国法研究发现，麦芽纤维经溃疡性结肠炎大鼠肠道内特定菌群发酵后能显著增加SCFAs含量，主要是乙酸、丙酸和丁酸，特别是丁酸既为结肠黏膜上皮细胞的修复提供了能量来源，也改善了肠道微生态环境，恢复了肠道菌群平衡，保护肠道黏膜屏障，对溃疡性结肠炎起到有效治疗作用。本研究结果表明不同来源和剂量的干预物对SCFA影响不同，高剂量山楂和麦芽处理及低剂量4 种复合物处理都能够改善甚至逆转维生素缺乏导致大鼠粪便中SCFA含量降低的不利趋势，而高剂量4 种复合物处理不但没有缓解作用，反而可能会加剧此不利趋势。

表2 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠粪便中SCFA含量的影响Table 2 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on SCFA contents in feces of vitamin-deficient rats

2.7 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠肠道菌群的影响

2.7.1 大鼠肠道菌群多样性

采用Chao1指数和Observed_species指数衡量-多样性。如图8所示，与M组相比，T4组的Chao1指数和Observed_species指数均显著下降（＜0.05），而T1、T2组和T3组大鼠肠道微生物的-多样性没有显著变化（＞0.05），这说明T4组大鼠肠道微生物多样性降低。研究表明膳食纤维能够促进肠道中益生菌的生长，从而调控肠道菌群结构，维持正常肠道菌群的稳态。然而，过量摄入膳食纤维会对肠道菌群产生不良影响，有引起菌群失调的风险。本实验为研究添加超过每日推荐剂量的膳食纤维是否能够进一步改善肠道功能，将T4组膳食纤维总摄入量设定为16 g/d，已超过学龄前期儿童每日膳食纤维适宜摄入量上限14 g/d。结果表明T4组大鼠肠道菌群多样性显著降低，过量摄入膳食纤维引起菌群失调，导致大鼠出现软便和稀便。因此，膳食纤维摄入过多可能导致维生素缺乏宿主的肠道菌群多样性降低，对宿主肠道健康造成不利影响。

图8 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠肠道菌群α-多样性的影响Fig. 8 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on α-diversity indexes of intestinal microorganisms in vitamin-deficient rats

2.7.2 大鼠肠道菌群结构属水平的变化

在已鉴定的菌属中取相对丰度含量排名前30 位的菌属，比较各组大鼠肠道菌群的差异。如图9所示，维生素缺乏会使大鼠肠道菌群中不同菌属的相对丰度发生变化，如降低拟杆菌属（）、布劳氏菌属（）、毛螺菌科中的其他属（Lachnospiraceae/Other）的丰度，增加、Ruminococcaceae/Other、Ruminococcaceae UCG-005、9的丰度。和毛螺菌科细菌都可以通过产生SCFA来促进宿主肠道健康。与M组相比，T2组和T3组都提高了和乳杆菌属的丰度，T3组还提高了的丰度。因此，产SCFA相关菌属丰度的增加可能是T2组和T3组总SCFA含量显著较高的原因之一。此外，T3组和T4组都提高了、副拟杆菌属（）和阿克曼氏菌属（）的丰度，且丰度的增加幅度与剂量呈正相关。大多数拟杆菌和副拟杆菌都能够降解膳食中多糖产生大量的SCFA，并在其细胞壁表面生成荚膜多糖，从而使其免受宿主和环境因素的不利影响，进而促进其在肠道中的竞争和适应性。本研究发现，与M组相比，相对丰度增加的T2组和T3组大鼠粪便中总SCFA含量显著增加了78.00%和44.91%，但T4组的总SCFA含量降低了4.93%。结合大鼠肠道菌群-多样性分析结果可知，过量摄入聚葡萄糖会使维生素缺乏大鼠肠道菌群中副拟杆菌过度生长，降低了肠道菌群的-多样性，导致菌群失调，反而不能增加宿主肠道中总SCFA含量。

图9 山楂、麦芽及膳食纤维对维生素缺乏大鼠粪便菌群菌属水平的影响Fig. 9 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on fecal microfloral composition at the genus level in vitamin-deficient rats

2.7.3 大鼠肠道菌群重要系统发育差异分析

采用LEfSe对所有处理组肠道菌群从门到属系统发育水平上进行两两比较，基于上述实验结果，主要分析T2组与M组间菌群构成的显著差异。图10A显示了不同组中丰度差异显著的物种，柱状图长度代表差异物种的影响大小，并通过将差异映射到已知层级结构的分类树上得到进化分支图，如图10B所示。筛选＜0.05、线性辨别分析（linear discriminant analysis，LDA）值大于3的菌群比较，相对于M组，T2组大鼠粪便中杆菌纲乳杆菌属（）、疣微菌门、Lachnospiraceae UCG_006的丰度显著增加；变形菌门（Desulfovibrionaceae）丰度显著降低。乳杆菌是肠道中常见的有益菌，刘永涛等发现麦芽纤维能通过显著提高溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群中乳杆菌属的丰度发挥良好的肠道菌群调控作用。毛螺菌科细菌可以通过产生SCFA促进宿主肠道健康，可通过调节肠道内黏液厚度和维持肠道屏障完整性发挥益生作用。宁素云等研究发现毛螺菌属及丰度在高剂量山楂粉组中显著上升，这些菌属可能是山楂粉改善高脂膳食模型小鼠肠道菌群构成的标志物，这与本研究中高剂量山楂和麦芽对维生素缺乏大鼠肠道菌群结构改善作用的结果一致。变形菌门所有细菌均为革兰氏阴性菌，大多数属于肠道中的有害菌，如产内毒素的促炎症脱硫弧菌属。因此，高剂量的山楂和麦芽粉能够通过改善肠道菌群结构，在增加有益菌丰度的同时降低有害菌的丰度，从而促进维生素缺乏宿主的肠道健康。

图10 大鼠肠道菌群LEfSe分析结果Fig. 10 LEfSe analysis of differences in intestinal microbiota of rats

2.7.4 大鼠肠道菌群的功能预测

为研究T2组与M组肠道菌群潜在功能的差异，通过PICRUSt软件基于物种组成预测T2组与M组中功能基因的构成，并用STAMP软件展示京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路中功能条目的丰度。PICRUSt软件可以通过16S RNA测序获得的物种构成推测样本中功能基因的构成，从而分析不同样本之间的功能差异，此方法对肠道微生物菌群的功能分析准确性接近95%，能很好地反映样品中的功能基因构成。

如图11所示，在KEGG二级代谢通路辅酶和维生素代谢下属的三级代谢通路中，相比于M组，T2组硫胺素代谢、核黄素代谢、泛醌和其他萜醌的生物合成、叶酸生物合成、过氧化物酶体通路上的基因丰度显著增加。过氧化物酶体含有多种依赖黄素的氧化酶和过氧化氢酶，可在多种代谢过程中发挥作用，包括脂肪酸氧化、消除活性氧簇和抗炎反应。叶酸参与生物体遗传物质和蛋白质的代谢，促进动物生长。因此，本研究结果表明高剂量山楂和麦芽可调控维生素缺乏大鼠肠道菌群结构，增加乳杆菌属、Lachnospiraceae UCG_006和等有益菌的丰度，降低产内毒素脱硫弧菌属的丰度，促进辅酶和维生素的合成，特别是硫胺素、核黄素及叶酸的合成代谢，进而促进依赖黄素的过氧化物酶体合成。过氧化物酶体促进脂肪酸-氧化，将长链脂肪酸分解为SCFA，进而增加肠道中SCFA含量，特别是作为结肠上皮细胞重要能量来源的丁酸含量显著提高。SCFA有助于维持肠道稳态，肠道稳态时肠细胞代谢趋于高耗氧的氧化磷酸化和脂肪酸氧化，由此形成的低氧环境又利于产丁酸的肠道专性厌氧菌的生长，它们的大量增殖能够维持肠道菌群平衡，保护肠道屏障完整性和调节能量代谢，同时通过增加小肠绒毛高度以及V/C值，促进肠道健康，最终提高大鼠肠道的吸收能力，从而使得高剂量山楂和麦芽能够显著提高维生素缺乏大鼠的体质量增量，缓解维生素缺乏对幼鼠生长发育的不利影响。

图11 大鼠肠道菌群不同代谢通路差异分析Fig. 11 Analysis of differential metabolic pathways of intestinal microbiota in rats

3 结 论

本实验研究了山楂和麦芽组合物，以及山楂、麦芽、低聚木糖和聚葡萄糖复合物对维生素缺乏幼鼠肠运动性、肠道菌群、肠道有益代谢产物、肠道形态结构等方面的影响。维生素缺乏会显著降低幼鼠的摄食量和食物利用率、小肠V/C值及SCFA含量，进而显著降低整个实验周期幼鼠的体质量增量。与M组相比，T2组与T3组都能促进产SCFA的Lachnospiraceae UCG_006和乳杆菌属，以及产黏蛋白的生长，分别将肠道总SCFA含量提高了78.00%和44.91%；同时改善了肠道组织形态，分别将空肠V/C值提高了52.65%和47.35%，从而改善维生素缺乏幼鼠肠道吸收功能，促进机体生长发育，特别是T3组的食物利用率显著提高了11.58%，T2组的体质量增量显著增加了14.77%。然而，过多摄入聚葡萄糖会使得过度生长，降低肠道菌群多样性，引起菌群失调，反而使维生素缺乏幼鼠肠道总SCFA含量较M组降低了4.93%，对肠道结构造成不利影响。目前，鲜有山楂、麦芽和低聚糖复合物通过调节肠道菌群结构来改善维生素缺乏幼鼠肠道功能的相关报道，本研究可为改善维生素缺乏症功能食品的开发提供科学依据。虽然水溶性维生素几乎无毒性，摄入量偏高一般不会引起中毒现象，但是脂溶性维生素摄入量过多易引起中毒现象。因此，针对处于生长发育期的学龄前儿童来说，可考虑在饮食中每天补充50 g的山楂和麦芽粉组合物或者10 g的山楂和麦芽粉组合物同0.7 g低聚木糖和3.3 g聚葡萄糖的复合物来缓解潜在的维生素缺乏导致的消化不良。