超微粉碎和高压均质联合处理对几丁质理化性质及微观结构的影响

刘 洋，肖 宇，马爱进，桑亚新，孙纪录,*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

几丁质是自然界中仅次于纤维素的第二大丰富的多糖，由-1,4-糖苷键连接的-乙酰基氨基葡萄糖组成，广泛分布于真菌的细胞壁、无脊椎动物和甲壳类动物的外骨骼中，其中甲壳类动物是几丁质的主要来源。近年来，虾、蟹等甲壳类动物的加工和消费量迅速增长，产生了大量的虾蟹壳等副产物，为几丁质的生产提供了丰富的原料。几丁质生物活性的不断发掘推动了几丁质产品在食品、农业和医药等领域的应用。目前，几丁质在食品工业中主要被用作膜材料和抗菌剂等。

几丁质降解的方法目前主要有3 种：化学法、物理法和酶法。化学法通常是使用强酸（如盐酸）使几丁质的糖苷键断裂，该方法不仅反应重复性差，而且会浪费大量的化学试剂，同时也会对环境造成污染。物理法主要是采用机械力、微波和超声等降解几丁质，目前国内外研究较少，一般不作为降解的主要方法，主要是用于辅助其他方法来共同降解几丁质。相对于其他方法，酶法能够在温和的条件下降解几丁质，并且降解过程以及降解产物都可控制，是目前较为理想的几丁质降解方法。几丁寡糖是几丁质的降解产物，其分子质量低、水溶性好、易于分散和吸收。目前，几丁寡糖的工业化制备仍然非常复杂，且成本较高。酶解反应条件温和，且对环境友好，因此，酶法降解几丁质为制备几丁寡糖提供了一条可行的途径。目前，几丁质酶难以获取而且价格昂贵，因此，一些非特异性酶被用来代替几丁质酶降解几丁质。这些非特异性酶种类多、来源广泛、价格低廉，甚至有些非特异性酶对几丁质的降解效率高于几丁质酶。

几丁质分子质量高，分子内和分子间氢键强，结晶度高，不溶于水、稀酸、碱性溶液和一般的有机溶剂，导致其难以酶促降解。因此，在酶解前可以对几丁质进行改性预处理。目前，已有多种物理方法改性几丁质的报道，包括超微粉碎、蒸汽爆破、瞬时弹射蒸汽爆破、超声和高压均质等。此外，也有使用有机溶剂、离子液体和超临界水对几丁质进行化学预处理的报道。蒸汽爆破和瞬时弹射蒸汽爆破原理相似，利用蒸汽强大的渗透力破坏几丁质的晶体结构，但该方法对几丁质的乙酰化会造成极大的破坏。超声能够打破几丁质相对较弱的氢键和范德华力，但是，经过冻干后样品会恢复晶体结构，结晶度不会降低，甚至会稍微升高。有机溶剂本身就具有毒性，并且会对环境造成一定的污染。离子液体价格较为昂贵。超临界水对处理条件要求较高。而超微粉碎和高压均质可以满足几丁质对溶剂的需要，破坏几丁质的结晶结构，削弱分子间的氢键网络，并且操作简单、成本较低。然而目前鲜见关于超微粉碎和高压均质联合处理几丁质的报道。

因此，为了打破几丁质的分子内和分子间的氢键网络，降低其分子质量，破坏其晶体结构，提高其酶促降解效率，本研究采用超微粉碎和高压均质两种物理方法联合处理几丁质；测定未处理和处理后的几丁质平均粒径、比表面积、孔隙体积、黏均分子质量、体积密度、振实密度和膨胀比率等理化特性；同时，采用傅里叶变换红外（Fourier transform infrared，FTIR）光谱法、元素分析、X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）、热重-差示扫描量热（thermogravimetric-differential scanning calorimetry，TG-DSC）法、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）对其微观结构进行表征；最后，使用木瓜蛋白酶和纤维素酶对几丁质进行降解，探究超微粉碎和高压均质联合处理对几丁质酶解反应是否起到促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

几丁质 生工生物工程（上海）股份有限公司。

无水LiCl 上海源叶生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、木瓜蛋白酶（20万 U/g） 北京博奥拓达科技有限公司；,-二甲基乙酰胺 福晨（天津）化学试剂有限公司；纤维素酶（3 U/mg） 北京索莱宝科技有限公司；KBr 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平 上海越平科学仪器有限公司；DE-100g万能粉碎机 浙江红景天工贸有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器、79-2双向磁力搅拌器 常州国宇仪器制品有限公司；QS-100S多功能高效球磨仪 五洲鼎创（北京）科技有限公司；APV-1000高压均质机 德国APV公司；LGJ-12型冷冻干燥机 北京四环起航科技有限公司；721G可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；Mastersizer 2000激光粒度仪、Zetasizer Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪 英国马尔文帕纳科公司；NOVA-2000e比表面积及孔径测试分析仪 美国康塔仪器公司；乌氏黏度计 上海申宜玻璃制品有限公司；IRAffinity-1S傅里叶变换红外光谱仪 日本岛津公司；EuroEA元素分析仪 意大利欧维特公司；Ultima IV X射线衍射仪 日本理学公司；STA 449F3同步热分析仪德国耐驰仪器制造有限公司；MERLIN Compact扫描电子显微镜 德国蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 几丁质的改性处理

将商品化几丁质记作原几丁质（raw chitin，RC），分别进行超微粉碎（ultra-micro grinding，UMG）、高压均质（high-pressure homogenization，HPH）和超微粉碎-高压均质联合处理（ultra-micro grinding-high-pressure homogenization，UMG-HPH）。

1.3.1.1 几丁质的超微粉碎处理

使用球磨仪对RC进行UMG处理。分别将2 g RC装入球磨仪两个腔室中，转速设置为1 400 r/min，时间设置为30 min，得到超微粉碎几丁质（ultra-micro grinding chitin，UMGC）。研磨前将腔室、研磨球和样品于液氮中浸泡5 min。

1.3.1.2 几丁质的高压均质处理

将RC配制成悬浊液（30 g/L），然后进行HPH处理，压力为40 MPa，时间为10 min，收集均质后的悬浊液，真空冷冻干燥，得到高压均质几丁质（high-pressure homogenization chitin，HPHC）。

1.3.1.3 几丁质的超微粉碎和高压均质联合处理

按照1.3.1.1节方法将RC制备成UMGC，然后用蒸馏水将UMGC配制成悬浊液（30 g/L），再按照1.3.1.2节方法对其进行HPH处理，收集均质后的悬浊液，真空冷冻干燥，得到超微粉碎-高压均质几丁质（ultra-micro grinding-high-pressure homogenization chitin，UMG-HPHC）。

1.3.2 理化性质的测定

1.3.2.1 粒径的测定

参考史早等的方法，RC的粒径分布采用激光粒度仪测定，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的粒径分布采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定，均在蒸馏水折射率1.33的条件下进行。取0.5 g样品于蒸馏水中充分振荡混匀，用胶头滴管吸取上述样品并缓慢加入装有500 mL水的烧杯中，同时进行搅拌，直到仪器显示的遮光度在测定范围内缓慢波动时，停止滴加样品并记录仪器数据。

1.3.2.2 比表面积和孔隙体积的测定

参考Tian Zhiqing等的方法，使用比表面积及孔径测试分析仪测定。使用N吸附/脱附等温线法测定几丁质的比表面积和孔隙体积。测定前，几丁质在100 ℃脱气12 h。

1.3.2.3 特性黏度和黏均分子质量的测定

参考张建旭等的方法测定几丁质的特性黏度[]，溶剂为质量分数5%的LiCl/,-二甲基乙酰胺溶液。[]的计算如式（1）所示。

式中：为/，为样品溶液流出乌氏黏度计所用时间/s，为溶剂流出乌氏黏度计所用时间/s；为样品溶液质量浓度/（g/mL）。

黏均分子质量（viscosity-average molecular mass，）通过Mark-Houwink-Sakurada方程（式（2））确定。

式中：为扩张因子（0.69）；为比例系数（0.24 cm/g）。

1.3.2.4 体积密度、振实密度和膨胀比的测定

参考Tan等的方法测定体积密度、振实密度和膨胀比。

体积密度：称量容积为100 cm的空杯质量（/g），将几丁质样品自由填充到杯中，去掉多余粉末，使粉末与杯顶部齐平，然后称质量（/g）。体积密度按公式（3）计算。

振实密度：称量容积为100 cm的空杯质量（/g），将几丁质样品自由填充到杯中，敲击100 次振实，去掉多余粉末，使粉末与杯顶部齐平，然后称质量（/g）。振实密度按公式（4）计算。

膨胀比：定义为未处理几丁质的体积密度（或振实密度）与处理后几丁质的体积密度（或振实密度）的比值。

1.3.3 微观结构的表征

1.3.3.1 傅里叶变换红外光谱分析

参考Delezuk等的方法，采用压片法进行FTIR分析。取200 mg溴化钾与2 mg几丁质样品于玛瑙研钵中充分研磨，压制成圆片，在FTIR仪上进行扫描，扫描范围为4 000～400 cm，分辨率为4 cm，扫描次数32。

1.3.3.2 脱乙酰度的测定

参考Zhang Wenchang等的方法，采用元素分析仪测定几丁质样品中C和N的相对含量，脱乙酰度（deacetylation degree，DD）按式（5）计算。

式中：是几丁质样品中C和N的质量比。

1.3.3.3 X射线衍射分析

参考张建旭等的方法，使用X射线衍射仪（靶：Cu-Kα；波长：1.541 8 nm；电压：40 kV；电流：40 mA）对几丁质样品进行分析，扫描速率为10°/min，扫描范围为5°～60°。（110）晶面和（020）晶面结晶度指数（crystallinity index，CrI）分别按公式（6）、（7）计算。

式中：和分别是2＝22°和2＝10°处的最大衍射强度；为2＝16°处的非晶衍射强度。

1.3.3.4 热重-差示扫描量热综合同步分析

参考Zhang Wenchang等的方法，使用同步热分析仪对几丁质进行TG-DSC分析。在N气氛下，升温范围为30～600 ℃，升温速率为10 ℃/min，收集升温过程中的数据。

1.3.3.5 扫描电子显微镜观察

参考Tian Zhiqing等的方法，将干燥的几丁质样品均匀地固定在SEM进样台上，真空条件下离子溅射喷金，采用SEM放大5 000 倍和50 000 倍进行微观结构观察。

1.3.4 几丁质的酶解反应

1.3.4.1 木瓜蛋白酶对几丁质的酶解反应

参考杜敬河的方法，将几丁质样品加入PBS（0.01 mol/L、pH 7.2）中配制底物溶液（50 mg/mL）。取1 mL底物溶液，加入1 mL木瓜蛋白酶溶液（10 mg/mL），于水浴摇床（37 ℃、180 r/min）中反应210 min。反应结束后，煮沸20 min，12 000 r/min离心2 min。同时设置对照组（向1 mL底物溶液中加入1 mL预先灭活的木瓜蛋白酶溶液，其余处理同上）。最后，使用二硝基水杨酸法测定上清液中还原糖含量。

1.3.4.2 纤维素酶对几丁质的酶解反应

参考杜敬河的方法，将几丁质样品加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液（1 mol/L、pH 4.8）中，配制成底物溶液（50 mg/mL）。取1 mL底物溶液，加入1 mL纤维素酶溶液（10 mg/mL），于水浴摇床（40 ℃、180 r/min）中反应210 min，反应结束后，煮沸20 min，12 000 r/min离心2 min。同时设置对照组（向1 mL底物溶液中加入1 mL预先灭活的纤维素酶溶液，其余处理同上）。使用二硝基水杨酸法测定上清液中还原糖含量。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 UMG和HPH联合处理对几丁质理化性质的影响

2.1.1 几丁质样品的外观变化

如图1所示，RC经过UMG处理后，UMGC粉末明显细化，并且出现了二次团聚现象；再经过HPH处理，所得UMG-HPHC粉末的质地明显蓬松，并且出现了更多的孔隙。

图1 RC（A）、UMGC（B）和UMG-HPHC（C）的外观图像Fig. 1 Appearance images of raw chitin (RC) (A), ultra-micro grinding chitin (UMGC) (B) and ultra-micro grinding-high-pressure homogenization (UMG-HPHC) (C)

2.1.2 几丁质样品的粒径变化

由表1可知，UMG和HPH处理会显著降低几丁质的粒径（＜0.05）。与RC相比，经UMG、HPH以及UMG-HPH处理后，、、和平均粒径均显著减小，其中，UMG-HPHC较RC分别减小99.31%、99.72%、99.82%和99.71%。这表明UMG的连续挤压和冲击力作用以及HPH的高速剪切和对流碰撞作用使几丁质颗粒得到细化，并且两种方法联合处理后粉末细化程度更高。

表1 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的粒径分布Table 1 Particle size distribution of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.1.3 几丁质样品的比表面积和孔隙体积变化

由表2可知，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的比表面积分别较RC增加-37.88%、209.23%和85.11%，孔隙体积分别增大-38.71%、177.42%和29.03%。在球磨仪中进行UMG处理之初，几丁质粒度细化，改变了几丁质的表面结构，使几丁质的表面结构变得更致密；随着UMG处理的进行，几丁质的细小颗粒又发生了二次团聚，最终导致比表面积减小。这一现象与Zhang Wenchang等的观察结果一致。HPH的空化效应能够增大几丁质比表面积和孔隙体积，这使得几丁质的作用面积增大，提高了几丁质的应用潜力。

表2 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的比表面积和孔隙体积Table 2 Specific surface areas and pore volumes of RC, UMGC,HPHC and UMG-HPHC

2.1.4 几丁质样品的黏均分子质量变化

几丁质的生物学效应和力学性能高度依赖于其分子质量。因此，几丁质的是一个非常重要的性能评价参数。UMG和HPH均为机械处理，会导致分子链的断裂和分子质量降低。分子质量的降低是由于糖苷键的断裂，糖苷键断裂后产生的自由基会进一步诱导其他活性基团的形成，从而有利于几丁质进一步降解，提高其溶解性。

由表3可知，经UMG、HPH以及UMG-HPH处理后，样品的特性黏度和均发生了不同程度的降低。与RC相比，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的分别降低了75.32%、80.05%和85.80%。由此可以看出，UMG和HPH处理都能使几丁质的降低，两种方法联合可以得到更低的几丁质。

表3 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的特性黏度和黏均分子质量Table 3 Intrinsic viscosity and viscosity-average molecular masses of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.1.5 几丁质样品的体积密度、振实密度及膨胀比变化

由表1、4可知，RC经过UMG处理后平均粒径大幅度降低，导致膨胀比下降。HPHC和UMG-HPHC分别是由RC和UMGC经HPH处理得到的，经振实密度计算的膨胀比较处理前分别增大3.98 倍和1.02 倍，说明HPH能够使几丁质的质地更加蓬松，表明几丁质的孔隙体积变大，这与比表面积及孔隙体积分析结果相印证。

表4 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的体积密度、振实密度和膨胀比Table 4 Bulk densities, tap densities and expansion ratios of RC,UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2 UMG和HPH联合处理对几丁质微观结构的影响

2.2.1 FTIR分析结果

红外光谱中吸收峰的位置及强度的变化与原子振动频率及其化学组成、化学键类型有着密切的关系。由图2可知，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的峰位置和形状基本与RC一致，说明UMG和HPH处理对几丁质的化学结构没有明显影响。在3 448 cm附近的吸收峰由O—H伸缩振动引起，3 263 cm附近的吸收峰由N—H伸缩振动引起，这两个吸收峰受氢键的影响较大。UMGC、HPHC和UMG-HPHC与RC相比，在3 448 cm和3 263 cm附近吸收峰强度提高，表明UMG和HPH处理破坏了几丁质之间氢键网络，使更多的羟基基团暴露。另外，2 961～2 840 cm处的吸收峰属于C—H伸缩振动。以上几种吸收峰均是多糖的特征吸收峰，表明样品的主要成分是含氮糖类物质。1 662 cm和1 631 cm处的两个吸收峰是-几丁质在酰胺I带（C＝O）的特征吸收峰，而1 564 cm和1 315 cm处的吸收峰分别代表酰胺II带（N—H）和酰胺III带（C—N）。1 160～1 020 cm为C—O伸缩振动的吸收峰，896 cm附近的吸收峰是由几丁质的-糖苷键伸缩振动引起的，896 cm处的吸收峰强度变弱，表明UMG和HPH处理可能使几丁质中的部分糖苷键断裂，这与黏均分子质量分析结果相印证。

图2 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的FTIR光谱Fig. 2 FTIR spectra of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2.2 脱乙酰度测定结果

由表5可知，通过UMG处理，RC的DD从7.84%下降到6.14%，再继续HPH处理，DD下降到5.84%。而通过HPH单一处理，RC的DD从7.84%下降到3.24%。这些结果表明，UMG和HPH均不能增大几丁质的DD。完全乙酰化几丁质的理论N相对含量为6.9%，本研究中不同几丁质样品的N相对含量在6.08%～6.48%之间，与之对应，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的DD均有所降低，尤其是HPH单一处理的样品DD降幅最大。目前，高乙酰度的几丁寡糖由于在医药和农业应用中能够改善生物反应而备受关注。乙酰基在结晶度较低、比表面积较大的改性几丁质中的保留将有利于乙酰化寡糖的合成。

表5 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的脱乙酰度分析Table 5 Deacetylation degree analysis of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2.3 XRD分析结果

由图3可见，2在19.2°附近为几丁质的主衍射峰，同时在9.4°、23.4°和26.3°附近有较小的衍射弱峰，呈现出典型的几丁质晶体结构。与RC相比，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的衍射峰位置没有明显变化，说明几丁质的晶型没有发生改变。但是，衍射峰强度均有所降低，说明在处理过程中几丁质结晶结构被破坏。结晶度与分子内和分子间氢键有着紧密关系，结晶度降低表明几丁质的氢键网络被破坏，这与FTIR光谱分析结果一致。在（110）晶面，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的结晶度指数分别降低了12.68%、3.85%和17.49%，在（020）晶面，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的结晶度指数分别降低了17.17%、4.08%和1.31%，表明经过UMG和HPH联合处理后，UMG-HPHC的有序度和结晶度降低。

图3 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的XRD图Fig. 3 X-ray diffraction diagrams of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2.4 TG-DSC综合分析结果

由图4A可见，几丁质的热分解过程主要分为3 个阶段。第一个热分解阶段发生在40～140 ℃，该阶段的质量损失是由几丁质分子内部的自由水和结合水逐渐蒸发引起，HPHC和UMG-HPHC蒸发速率明显高于RC，是由于结晶结构阴碍水的进出，低结晶度几丁质的蒸发速率更快，蒸发温度相对降低。

第二个质量损失阶段发生在200～450 ℃，这是样品质量损失率最高的阶段，主要原因是几丁质的分解。由于经过UMG处理的几丁质粒径减小，经过HPH处理的几丁质比表面积增加，孔隙体积扩大，所以UMGC、HPHC和UMG-HPHC受热面积增大，受热更加均匀，使其分解速率加快。450 ℃之后，几丁质分解进入平缓的第三个阶段，此阶段主要是热解残余物缓慢分解产生碳和灰分。

由图4B可见，由于几丁质的自由水和结合水的蒸发，所有样品均在150 ℃之前有较宽的吸热峰。4 个样品的峰值不同，可能与结晶度有关。UMG-HPHC的峰值出现在94.14 ℃，较其他样品峰值延迟，是因为结晶度的降低使几丁质的吸水能力增强。

图4 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的TG-DSC综合分析Fig. 4 TG-DSC analysis of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2.5 扫描电子显微镜观察结果

由图5可见，未经过处理的RC表面光滑、结构有序、孔洞分布均匀（图5A、A）；经UMG处理后的UMGC结构被破坏，表面呈现堆叠现象，孔洞消失（图5B、B），并且可以观察到几丁质团聚形成聚集体，当几丁质颗粒足够小时，其粗糙度和颗粒表面的凹凸度等发生改变，都可能引起几丁质发生聚集，这也是比表面积减小的原因；经HPH处理后的HPHC结构遭到严重破坏，形成杂乱的网状多孔结构，并且能够清晰地看到疏松多孔的蓬松结构（图5C、C）；UMG-HPHC的微观结构（图5D、D）和HPHC相似，具有疏松多孔的蓬松结构。以上结果表明，UMG和HPH处理对几丁质的结构有明显影响。

图5 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的SEM图Fig. 5 SEM images of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.3 UMG和HPH联合处理对几丁质的酶解效率的影响

如图6所示，木瓜蛋白酶和纤维素酶降解4 种样品的还原糖产量均为UMG-HPHC＞HPHC＞UMGC＞RC。在木瓜蛋白酶和纤维素酶对几丁质的降解中，UMG-HPHC的还原糖产量比RC分别提高了6.05 mg/mL和0.87 mg/mL，表明UMG和HPH处理对木瓜蛋白酶和纤维素酶降解几丁质有积极作用，并且UMG和HPH联合处理效果最佳，体现出一定的协同增效作用。经过联合处理的改性几丁质降低、结晶度减小、比表面积增大，形成网状多孔结构。这些理化性质和微观结构的变化均有助于改善几丁质的溶解度，并可能增加酶与底物的结合位点，从而提高酶对几丁质的降解效果。

图6 不同改性处理对几丁质酶解效率的影响Fig. 6 Effects of different modification treatments on enzymatic degradation efficiency of chitin

3 结 论

为了打破几丁质分子内和分子间的氢键网络，降低其分子质量，破坏其晶体结构，以提高几丁质的酶解效率，本实验研究了UMG和HPH联合处理对几丁质理化特性和微观结构的影响。结果表明，经过UMG单一处理后，几丁质颗粒得到细化，结晶度降低。UMG和HPH联合处理能够得到既细化又蓬松的改性几丁质粉末，并且改性后的几丁质孔隙体积和比表面积增大，平均粒径和降低，分子间氢键网络被破坏，更多的羟基基团暴露，部分糖苷键断裂，结晶度和热稳定性降低，同时形成了网状多孔结构，使更多的结合位点暴露。与RC和单一改性处理的几丁质相比，联合处理改性的几丁质更易被木瓜蛋白酶和纤维素酶降解。此外，改性后几丁质的脱乙酰度有所降低，为制备高乙酰度的几丁寡糖提供了有利条件，也保证了几丁质进一步衍生化的可能性和多样性，如制备可溶性或具有功能特性的几丁质衍生物等。综上，UMG和HPH联合处理有效改善了几丁质的理化和结构特性，作为一种操作简单且对环境友好的处理方式，可作为促进几丁质酶促降解的一条有效途径，同时提高几丁质的应用潜力。