基于化学计量学结合甘油二酯和甘油三酯分析的橄榄油等级的鉴别

赵善贞， 封卓然， 包 明， 伊雄海， 邓晓军， 郭德华， 丁 涛， 柳 菡

(上海海关动植物与食品检验检疫技术中心1，上海 200135) (南京海关动植物与食品检测中心2，南京 210000)

橄榄油属木本植物油，是由新鲜的油橄榄果实直接冷榨而成的，被认为是迄今所发现的油脂中最适合人体营养的油脂。橄榄油的主要成分是甘油三酯(Triglycerides，TAGs)和甘油二酯(Diacylglycerol，DAGs)，其中甘油三酯质量分数高达95%～98%[1]，其余成分包括游离脂肪酸、甾醇、酚类物质等，这些物质在橄榄油在加工过程中会产生一定变化。为了对橄榄油的真实属性进行确认，欧盟[2]和国际橄榄油理事协会[3]早在90年代就建立了橄榄油和橄榄果渣油特性及分析方法法规，我国在2019年也制定了橄榄油分级的相关标准法规[4]。

除了制定与施行各种标准法规以外，有效的橄榄油掺伪检测手段也尤为重要，橄榄油的真伪鉴别[5-6]和质量分级检测[7-9]一直以来都是国内外学术界的研究热点。近年来，随着化学计量学的大力发展，采用主成分分析和聚类分析等统计学方法，研究食品化学测量值与体系的状态之间建立联系成为一个研究热点[10-13]，国内针对油脂化学计量学现有报道涉及橄榄油的微量元素[14-15]、脂肪酸[16]、风味物质[17]，挥发性特征成分[18]等。国外对油脂的真实属性进行确认，也建立了较多计量学分析方法[19]。对不同产地、品种橄榄油的鉴别[20-22]；不同种类油脂或者掺假鉴别[23-27]，方法多采用橄榄油中的TAGs、DAGs结合甾醇类，脂肪酸等的检测，并进行化学计量学分析，未有仅采用TAGs、DAGs进行检测，结合化学计量学分析的报道。而针对对不同等级橄榄油中的鉴别有紫外吸收光谱分析[28]，毛细管电泳法[29]，甘油二酯和脂肪酸之间的比例[30]，以及甘油二酯同分异构体之间的差异[31]等。采用紫外吸收光谱分析方法，影响检测结果准确度的因素较多；毛细管电泳法方法直接通过不同等级橄榄油的电子影像分析图差异来进行PCA分析，方法对图谱要求较高；而采用气相色谱-质谱法测定橄榄油中的甘油二酯和脂肪酸含量，前处理通常需要衍生，较为繁琐。本方采用高效液相色谱-大气压化学电离源-质谱/质谱法对初榨橄榄油和精炼橄榄油中的DAGs和TAGs进行测定，样品经稀释后直接上机分析，根据测得的DAGs以及TAGs的母离子、子离子进行定性分析，推测可能的DAGs以及TAGs类型，再对各类型的DAGs和TAGs进行定量分析，结合化学计量学方法，对初榨橄榄油和精练橄榄油进行等级鉴别，并找出差异性物质。现有报道中，通过TAGs和DAGs含量差异结合化学计量学方法对橄榄油进行等级鉴别的方法较为少见，本方法前处理方法简单，数据处理简便，可为橄榄油等级鉴别提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈，丙酮 (色谱纯)，0.45 μm 滤膜，有机系。已确认属性的16种初榨橄榄油和26种精炼橄榄油样品，均收集于国内外各橄榄油企业，5种未知属性的橄榄油作为测试样品对建立的方法进行验证。本方法中初榨橄榄油为1～16号样品，精炼橄榄油为17～42号样品，测试样品为S1～S5号样品。

1.2 仪器与设备

API 4000液相色谱-质谱/质谱仪，配有APCI源。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取(0.5±0.001)g 试样于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，制备成5%的样品溶液，经0.45 μm 滤膜过滤，液相色谱-质谱/质谱仪进行定性和定量分析。

1.3.2 液相色谱条件

借鉴何榕等[32]的方法并稍作修改。色谱柱：Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，粒径5 μm) 3根串联；流动相：丙酮/乙腈(50∶50)；等度洗脱；洗脱时间：120 min；流速： 0.2 mL/min；进样量：10 μL。

1.3.3 质谱条件

正离子模式；质荷比(m/z)范围：300～1 050；APCI源温度：250 ℃。

1.4 数据处理与化学计量学分析

采用SPSS 24.0 软件对测得的DAGs以及TAGs数据进行整理，并计算不同等级橄榄油中DAGs、TAGs的组内方差和组间方差。将整理后的数据导入到SIMCA 14.0软件中进行PCA、PLS-DA分析，并进行置换检验来验证模型的可靠性。采用Metaboanalyst 6.0进行HCA分析。

2 结果与分析

2.1 DAGs以及TAGs的定性和定量分析

含有长链脂肪酸的DAGs、TAGs，随着烃基碳链的增多极性越来越弱，而APCI源适用于弱极性化合物的检测，因此这里采用APCI源对DAGs和TAGs进行分析。DAGs和TAGs在APCI源中主要形成3种类型的碎片离子： 酰基离子[RCO]+、单酰基甘油离子[M+H-RCOOH-RCO]+，以及二酰基甘油离子[M+H-RCOOH]+等。根据这些碎片离子峰的特征，可以推测甘油三酯的结构。

在质荷比(m/z)300～1 050内对试样进行全扫描后，参考已有文献[33]中DAGs以及TAGs的母离子，对扫描范围内的母离子的质荷比进行提取。根据提取到的母离子、子离子，和已有报道的DAGs以及TAGs的母离子以及子离子进行比对，推测出可能的DAGs以及TAGs的类型。本方法检测到的橄榄油中的DAGs包括LL、OL、OO、OS等DG，TAGs包括LLL、OLLn、OLL、OOLn、POLn、PLnP、OOL、POL、OOO、POO、POP、OMoO等，本方法检测到的橄榄油中的甘油二酯以及甘油三酯见表1。

表1 本方法检测到的橄榄油中的甘油二酯以及甘油三酯

根据初榨橄榄油和精炼橄榄油的定性分析结果，提取各类型的DAGs以及TAGs，对DAGs以及TAGs进行定量分析。以归一化法计算各DAGs以及TAGs相对质量分数，2种等级橄榄油中DAGs以及TAGs的相对质量分数见表2。

表2 两种等级橄榄油中DAGs以及TAGs的相对质量分数

2.2 不同等级橄榄油的化学计量学分析

2.2.1 DGs以及TAGs的PCA分析以及PLS-DA分析

采用SPSS 24.0软件进行主成分分析(PCA)以及偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。方法首先以本文中所检测到的所有DAGs以及TAGs的响应值为变量进行分析。两种等级橄榄油等级鉴别的PCA图及PLS-DA图如图1所示，可以看出初榨橄榄油样品位于图1右下侧，精炼橄榄油样品位于图1的左上侧，但是两者之间分界不明显，部分橄榄油在等级差异分析中存在难以鉴别的情况。

图1 橄榄油等级鉴别的PCA图及PLS-DA图

2.2.2 数据显著性差异分析

主成分分析的实际应用中，采取的是变量变换手段，最终目的就是为了根据实际的情况，选取几个几乎可以涵盖所有总体信息的主成分，以达到降维的目的，并在此基础上进行进一步的分析[34]。这里对两种等级橄榄油中各DAGs和TAGs采用假设检验(hypothesis testing)[35]，进行显著性差异分析。计算不同等级橄榄油中DAGs和TAGs中各变量的F值和P值。F值是各组分组间方差和组内方差的比率，F值可以用来计算各个变量对给定组分的贡献度。F值越大，表示变量之间的差异性越大。另一个参数P值为F值的倒数，也用于表示分组错误的可能性。P<0.05时，该变量之间有统计学差异，P<0.01时,变量之间有极显著差异。对上述初榨橄榄油和精炼橄榄油DAGs、TAGs各组分的峰面积的组间方差和组内方差进行计算，求出各变量的F值以及P值，对F值由大到小，即P值由小到大进行排序，甘油二酯、甘油三酯的F值和P值，由表3可以看出，DAGs中的LL、OO、OL以及TAGs中的OLLn、LLL、OOL以及OLL的P<0.05。这表明这些DAGs和TAGs存在显著差异，和不同等级橄榄油的等级鉴别关联性较强。

表3 甘油二酯、甘油三酯的F值和P值

2.2.3 有显著性差异的DGs和TAGs的PCA分析以及PLS-DA分析

采用所有检测到的的DAGs以及TAGs进行PCA和PLS-DA分析效果并不理想，因此这里取上述经显著性差异分析后，P<0.05的橄榄油DAGs以及TAGs组分，即DAGs中的LL、OO、OL以及TAGs中的LLL、OLLn、OOL、OLL进行PCA以及PLS-DA分析。两种等级橄榄油等级鉴别的PCA图及PLS-DA图如图2所示，给出采用有显著性差异的DGs和TAGs分析的PCA图(图2a)以及PLS-DA图(图2b)。经过显著性差异分析后，2种不同等级橄榄油之间分离度增加， 样品组内可得到较好的聚类分离效果，不同等级橄榄油在2个模型中的分布情况十分相似。PLS-DA作为有监督的模式判别模型，具有一定的数据过拟合风险，需要对建立的模型进行置换检验。作为一个可靠的有监督模型，Q2回归线在y轴上的截距要小于0。初榨橄榄油的确证模型中，R2回归线在y轴上的截距为-0.003 27；Q2回归线在y轴上的截距为-0.115；精炼橄榄油的确证模型中，R2回归线在y轴上的截距为0.003 6；Q2回归线在y轴上的截距为-0.105，2个确证模型的Q2均小于0；这表明本方法建立的PLS-DA模型是可靠的。

图2 橄榄油等级鉴别的PCA图及PLS-DA图

图3 基于DAGs和TAGs的2种等级橄榄油鉴别的聚类分析热图

2.2.4 聚类分析

聚类分析(HCA)是聚类算法的一种，通过计算不同类别数据点间的相似度来创建1棵有层次的嵌套聚类树。本方法对具有显著性差异的DAGs和TAGs，采用HCA对进行聚类和评估变量。基于DAGs和TAGs的两种等级橄榄油鉴别的聚类分析热图如图3所示，由图3可以看出，通过HCA分析，样品被分为2类，且均可正确分类。由此可见，本方法采用PCA和PLS-DA建立的橄榄油鉴别方法是可靠的。

2.2.5 特征化合物的确定

在PLS-DA分析中，自变量投影重要性指标(VIP)被用于判断单个自变量在解释因变量时的重要性，是PLS模型的精度分析以及影响机制。对有显著差异的TAGs和DAGs建立的PLS-DA模型，其VIP值进行考察，可以看出LL、OLLn、LLL、OO的VIP值大于1，是橄榄油等级鉴别模型的重要变量。TAGs和DAGs中的LL、OLLn、LLL、OO在2种橄榄油中的相对含量差异较大，在2种等级的橄榄油鉴别中起着重要作用。

2.3 实际样品测定

对市售的5个精炼橄榄油样品进行检测后，采用建立的PCA和PLS-DA模型对样品进行分类，橄榄油样品都和精炼橄榄油的位置更接近，因此将该5个样品归类为精炼橄榄油，和样品标签标识一致。

3 结论

本方法采用HPLC-APCI-MS/MS法对不同等级橄榄油中的DAGs以及TAGs进行定量测定。建立了不同等级橄榄油的PCA以及PLS-DA鉴别模型。结果表明DAGs中的LL、OO，TAGs中的LLL、OLLn是橄榄油等级鉴别模型的重要变量，这4种DAGs以及TAGs在精炼橄榄油中的含量高于其在初榨橄榄油中的含量。采用HAC可以对橄榄油进行准确分类，可为不同等级橄榄油等级鉴定提供新思路。