HPLC法测定邓氏清毒饮中绿原酸的含量

黄明文，黄水华★，陆国寿

（1. 广东博罗县中医院，广东 博罗 516100 ；2. 广西壮族自治区中医药研究院，广西 南宁 530020）

邓氏清毒饮为博罗县的新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）疫情预防方。2020 年1 月25 日起，博罗县卫健局组织县中医医院按照邓氏清毒饮方煎制中药预防汤剂，向一线医护人员派发了5 9309 份中药汤剂，并为从湖北返回博罗县进行医学监测人群、部分工勤人员派发了免费的预防中药汤剂。同时，将邓氏清毒饮派发给有需要的市民，已累计面向社会派发了12万份中药汤剂。为了更好地将邓氏清毒饮应用于新冠肺炎疫情防控中，我们综合中医处方解析、药材化学物质基础、药材的相关药理作用三方面来对邓氏清毒饮用于新冠肺炎防控的可行性进行分析，并根据分析结果采用高效液相色谱法（HPLC）对邓氏清毒饮中活性成分绿原酸进行了含量测定研究。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 高效液相色谱仪（2998 PDA Detector，Waters e2695 Separations Module，Empower 3 色谱工作站，美国Waters）；XS-205 天平（瑞士梅特勒）；JJ224BC 天平（常熟双杰）；KS-3200DE 超声仪（昆山洁力美）。

1.2 试药

邓氏清毒饮（自制，批号：DSQDY20201101、D S Q D Y 2 0 2 0 1 1 0 2 、 D S Q D Y 2 0 2 0 1 1 0 3 、DSQDY20201104、DSQDY20201105），绿 原 酸 对 照品（中国食品药品鉴定研究院提供，批号：110753-202018，含量测定用）。甲醇等试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5-Micron），流动相：乙腈-0.1% 磷酸（10:90），流速：1.0 mL/min，柱温：25 ℃，波长：326 nm，进样量：10μL。在上述色谱条件下，绿原酸与其他色谱峰分离度＞1.5，且阴性样品无干扰。色谱图详见图1。

图1 对照品（A）、供试品（B）和阴性样品（C）的高效液相色谱图

2.2 对照品溶液的制备

取绿原酸用50% 甲醇溶液制备得对照品储备液（278.25 μg/mL）。

2.3 供试品溶液的制备

取邓氏清毒饮5 mL，置于10 mL 量瓶中，加水稀释，即得供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液的制备

按处方除去金银花、野菊花、蒲公英药材，水煮制得阴性样品适量，按“2.3”项下方法制成阴性样品溶液。

2.5 线性关系考察

精密量取“2.2”项下的对照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀释，精密吸取 10μL，进样测定，以进样质量浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积（A）为纵坐标（Y），进行线性回归。结果显示，绿原酸在13.91 ～278.25 μg/mL 范围内线性关系良好，回归方程为Y=23745.2X-30573.8，r=0.9999。

2.6 精密度试验

取绿原酸对照品溶液，连续进样6 次测定，计算得出绿原酸峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.56%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品（批号：DSQDY20201101）溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h 依次进样测定，计算得出绿原酸峰面积的RSD 为0.73%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.8 重复性试验

取同一批样品（批号：DSQDY20201101）6 份，制备，测定，计算得出样品中绿原酸的平均含量为109.16 μg/mL，RSD 为1.09%（n=6），表明该方法重复性较好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：DSQDY20201101）6份，各2.5mL，加入1mL 含绿原酸（278.25μg/mL）的对照品溶液，按“2.3”项下方法制备对照品溶液，测定并计算绿原酸的回收率，如表1 所示，绿原酸的平均回收率为100.03%，RSD 为1.23%。

表1 绿原酸加样回收率试验结果

2.10 含量测定

取不同批次的样品5 mL，制备，测定，计算不同生产批次邓氏清毒饮中绿原酸的含量，如表2 所示，5 个生产批次邓氏清毒饮中绿原酸的平均含量为114.07 μg/mL。

表2 不同生产批次邓氏清毒饮中绿原酸含量的测定结果（μg/mL）

3 讨论

3.1 邓氏清毒饮防控新冠肺炎的可行性分析

邓氏清毒饮由金银花、野菊花、桑叶、蒲公英、白茅根、苇茎、诃子、乌梅、党参、五指毛桃、谷芽、甘草12 味中药材组成。方中各味药材中的化学成分及药理活性如下：1）金银花[1]中含有绿原酸、木犀草素、木犀草苷等成分，具有抗菌、解热、抗炎、抗病毒、增强免疫力等药理作用；2）野菊花[2-3]中含有月桂酸、反丁香烯、绿原酸等成分，具有抗菌、清除自由基、抗微生物等药理作用；3）桑叶[4]中含有桑呋喃F1、yunanensin E、异槲皮苷等成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、清除自由基、抗衰老等药理作用；4）蒲公英[5]中含有东莨菪内酯、伞形花内酯、绿原酸、蒲公英甾醇等成分，具有抗菌、抗病毒、提高免疫力等药理作用；5）白茅根[6]中含有芦竹素、白茅素、麦黄酮、白头翁素、薏苡素等成分，具有利尿、抗菌、免疫调控、抗炎等药理作用；6）苇茎[7]中含有咖啡酸、阿魏酸、禾草碱、蟾毒色胺等成分，具有免疫促进、解热、抗菌等药理作用；7）诃子[8]中含有Fragment1 ～8、单宁酸等成分，具有抑菌、提高免疫功能等药理作用；8）乌梅[9]中含有柠檬酸、愈创木酚、叔丁基脲等成分，具有抗菌、镇咳等药理作用；9）党参[10]中含有党参碱、党参炔苷、蒲公英萜醇、柯伊利素、苜蓿素、芹菜素、咖啡酸等成分，具有调节免疫系统、抗菌、抗病毒等药理作用；10）五指毛桃[11]中含有补骨脂素、佛手柑内酯、柚皮素等成分，具有止咳、祛痰、平喘、提高免疫功能、抑菌等药理作用；11）谷芽[12]中含有多糖类成分，具有清除超氧阴离子自由基、抗氧化等药理作用；12）甘草[13]中含有甘草酸、甘草查尔酮甲、甘草苷等成分，具抗炎、抗病毒、解毒、镇咳祛痰等药理作用。

中国中西医结合学会发布的《新型冠状病毒肺炎中西医结合防治专家共识》中认为新冠肺炎发病的中医病因为感受“疫疠”之气，病机特点为“湿、热、瘀、毒、虚”。博罗县位于南方湿瘴之地，故考虑邓氏清毒饮中以金银花为君药，根据其“归肺经，功能清热解毒，疏散风热”等归经及功效特点，首从解决本“疫”病的“湿、热、毒”病机入手。野菊花可“清热解毒，泻火平肝”、桑叶可“疏散风热，清肺润燥”、蒲公英可“清热解毒”、白茅根可“凉血止血，清热利尿”，此四味药味为臣药，共助金银花解决“湿、热、毒”病机。蒲公英可“消肿散结”，兼顾解决本“疫”病的“瘀”病机。苇茎、诃子、乌梅皆归肺经，其中功效分别为苇茎可“清肺解毒，止咳排脓”、诃子可“敛肺止咳”、乌梅可“敛肺”，三者为佐药，共达“清肺敛肺，止咳排脓”之功效。党参归脾、肺经，功效“健脾益肺，养血生津”；五指毛桃归脾、肺、胃经，功效“健脾益气，行气利湿”；谷芽归脾、胃经，功效“消食和中，健脾开胃”，三者为使药，考虑以其归脾、肺经，功能健脾益肺、益气和中，此归经及功效特点，能解决本“疫”病病机中的“虚”症。甘草具有“清热解毒，祛痰止咳，调和诸药”之功效，在协助各药味解决“热、瘀”病机的同时，亦起到缓解药物毒性、烈性的作用。综上所述，本方具有解毒御邪、清肺润燥、顾护元气的功效。

从传统中医角度来解析，邓氏清毒饮主要从清热解毒、敛肺止咳、健脾益肺等角度来解决新冠肺炎这一中医范畴的“疫”病，解决其“湿、热、瘀、毒、虚”等病机。从药理学角度分析，本方的药效主要与抗病毒、抗菌、镇咳祛痰、免疫调节、抗氧化五个方面的药理作用有关。值得关注的是，处方的部分中医功效能较好地采用现代药理机制来解释，如清热解毒的功效可以用抗病毒、抗菌等药理作用来解释，敛肺止咳的功效可以用镇咳祛痰的药理作用来解释，顾护元气的功效可以用免疫调节等药理作用来解释。从药味中活性成分的角度来分析，方中部分药味的活性成分亦能在一定程度上对本方的功效进行解释，如金银花中的绿原酸具有抗病毒、抗菌的作用，党参中的多糖成分具有免疫调节的作用。

3.2 含量测定指标成分的选择及实验条件摸索

查阅文献[1-3]，金银花、野菊花、蒲公英中均含有绿原酸成分。绿原酸具有较好的抗病毒作用[14-15]，是本方的主要药物活性成分之一，故选择其作为含量测定的指标成分具有较好的质量监控作用。依据文献方法[5-8]，本实验比较了乙腈-甲酸水、乙腈-磷酸水、甲醇- 磷酸水等不同流动相在邓氏清毒饮中活性成分绿原酸含量测定中的价值，结果表明，以乙腈-0.1%磷酸水为流动相，绿原酸的分离效果较好，干扰成分少，分离度达到要求。本研究采用PDA 检测器，在200 ～400 nm 范围内对绿原酸进行全波长扫描，其在326 nm 处有最大吸收，故选择波长为326 nm。

本研究通过开展相应含量测定等质量监控工作，可更好地保证邓氏清毒饮质量的稳定性，使其能更好地在新冠肺炎防控工作中发挥作用。