Th17在AS患者外周血中的表达及意义

户小均，马 骥，黄 丹

（绵阳市中心医院，四川 绵阳 621000）

强直性脊柱炎（AS）是一种慢性炎症性疾病，以髂骶关节、脊柱以及外周关节为主要病变部位，同时伴有不同程度的心血管、肺部病变。调查发现，截至2019 年我国AS 患病率在0.44% 左右，男性的发病风险更高，且好发于青壮年群体，对患者家庭及社会均会造成一定负担[1]。AS 具有一定的家族聚集性，属于与遗传相关的自身免疫性疾病，但患者免疫功能的改变与遗传发病的机制目前并未阐明。关于AS 与T细胞亚群的研究存在较多争议，有学者在研究中发现了一种新的T 细胞亚群——辅助性T 细胞17（Th17）。该细胞属于效应CD4+T 细胞，来源于Th0，具有与Th1、Th2 差异的独立分化途径，且已有大量研究证实Th17在自身免疫性疾病、炎症疾病中具有重要作用[2]。本研究为分析AS 患者外周血中Th17 的表达水平及其在疾病发生机制中的作用，对我院收治的AS 患者及同时期的健康受试者进行对比，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2021 年1 月至12 月收治的AS 患者30例为研究组，选择同一时期于我院进行体检的健康受试者30 例为对照组。纳入标准：1）研究组患者经我院检查确诊为AS ；2）对照组受试者为本院体检结果健康人群；3）签署同意书者。排除标准：1）合并其他自身免疫性疾病者；2）合并恶性肿瘤者；3）出现严重感染性疾病或高热症状者。剔除标准：1）不能参与研究全过程者；2）研究过程中出现突发性疾病且对研究结果产生影响者；3）未按照本研究要求进行试验者。研究组中有男16 例、女14 例，年龄24 ～41 岁，平均（32.52±4.11）岁。对照组中有男17 例、女13 例，年龄23 ～40 岁，平均（32.51±4.09）岁。两组受试者的性别、年龄对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 检测仪器 流式细胞仪（赛默飞世尔，Attune）；细胞培养箱。

1.2.2 检测方法 1）Th17、Th1、Th2 ：抽取两组受试者的静脉血3mL，以肝素钠抗凝，参照固定比例进行全血细胞刺激培养4h，之后用磷酸盐缓冲剂冲洗。分成5 管，分别在其中加入10μL 抗CD4 抗体进行染色，置于室温暗处30min。加固定剂50μL，室温放置15min。加入4mL PBS 清洗剂，以1500r/min 转速离心10min，去上清液，加通透剂30μL。之后分别在5 管中加入抗白细胞介素-17（IL-17）抗体、IL-4 抗体、γ 干扰素（IFN-γ）抗体、FTTC 以及PE 抗体进行同种型对照，混合均匀后在室温暗处放置15min。洗涤1 次，去上清液，加PBS500μL 支撑细胞悬液，待检。2）人类白细胞抗原B27（HLA-B27）：分别在各反应管中加入100μL 肝素钠行抗凝处理，再加入相应单克隆荧光抗体10μL，混匀，以同型抗体做阴性对照，室温避光保存30 min，溶血。之后加入PBS4mL，以1500 r/min 转速离心5min，洗涤2 次，去上清液，加PBS500μL 配置细胞悬液，待检。阳性标准：分析细胞群百分比、平均荧光强度，HLA-B27*/B7-平均荧光强度＞8 或细胞群百分比＞90%表示呈阳性。3）红细胞沉降率（ESR）：以魏氏法取受试者静脉血3 mL 进行检测。4）C 反应蛋白（CRP）：以速率散射比浊法取受试者静脉血3 mL 进行检测。

1.3 观察指标

1）对比组间Th17 的表达水平。2）对比组间Th1、Th2 的表达水平。3）分析研究组Th17 的表达水平与HLA-B27、CRP、ESR 之间的相关性。

1.4 统计学方法

将本研究数据录入SSPS12.0 统计软件进行统计学处理，计量资料采用±s表示，行独立样本t检验；计数资料采用% 表示，行χ² 检验；相关性分析采用Spearman 分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对比组间Th17 的表达水平

研究组Th17 的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 对比组间Th17 的表达水平（%，± s ）

表1 对比组间Th17 的表达水平（%，± s ）

组别 Th17研究组（n=30） 2.77±0.73对照组（n=30） 1.21±0.44 t 值 10.025 P 值 ＜0.001

2.2 对比组间Th1、Th2 的表达水平

研究组Th1 的表达水平明显低于对照组，Th2的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 对比组间Th1、Th2 的表达水平（%，± s ）

表2 对比组间Th1、Th2 的表达水平（%，± s ）

组别 Th1 Th2研究组（n=30） 3.77±0.91 4.22±1.01对照组（n=30） 4.88±1.01 3.04±0.77 t 值 4.472 5.089 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 研究组Th17 的表达水平与HLA-B27、CRP、ESR 之间的相关性

研究组HLA-B27 的检测结果为阳性，ESR为（32.54±2.24）mm/h，CRP 为（31±9）mg/L。经Spearman 分析发现：研究组Th17 的表达水平与HLA-B27 百分比、HLA-B27 平均荧光强度及ESR、CRP 无 明 显 相 关 性（r=0.415、r=0.151、r=0.086、r=0.289，P均＞0.05），但Th17 的表达水平会随着HLA-B27 百分比及HLA-B27 平均荧光强度的增加而升高。

3 讨论

AS 起病缓慢且早期症状不明显。此病患者的临床表现主要为腰骶部钝痛、晨僵或翻身困难，稍活动后减轻，随着病情进展，疼痛会逐渐从腰椎进展至胸椎、颈椎等，严重时可发生脊柱畸形。研究显示，AS具有家族聚集性，此病患者的一级亲属患有AS 的概率高达30%。免疫因素在AS 的发病过程中发挥着重要作用，目前共发现100 多种细胞因子、趋化因子参与AS 的炎性反应，AS 患者体内的免疫炎症因子水平要高于正常人群[3]。大量研究证实，与类风湿性关节炎（RA）相比，AS 患者体内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IFN-γ 的分泌量均明显减少。但也有研究指出，TNF-α 在AS 中呈现升高趋势，认为该因子在多种脊柱关节病的发病机制中起着重要作用[4]。近年来有研究证实，参照细胞发育、功能及分泌细胞因子作用的差异，CD4+T 淋巴细胞应细化为Th1、Th2、调节性T 细胞及Th17 四大亚群[5]。Th17 亚群分化、功能均受Th1 和Th2 因子的影响，而IL-17 能够在免疫、防御中起到重要作用，生成调控粒细胞，阻断细胞外病原体入侵。

近年来临床上关于Th17 亚群的产生、分化机制及在RA 中表达水平的研究较多，但关于其在AS 中的表达情况及在本病发生、发展中作用机制的研究较少。本研究借助流式细胞术分析AS 患者体内Th17 表达水平与健康受试者的差异，以及Th17 在AS 进展过程中的作用机制[6]。本研究显示，研究组Th17 的表达水平明显高于对照组，差异统计学意义（P＜0.05）；研究组Th1 的表达水平明显低于对照组，Th2 的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。原因在于，Th1、Th2 及Th17 型细胞因子之间关系复杂，且IL-17 主要是通过促进细胞、核因子受体活化而发挥作用。同时发现，转化生长因子（TGF）-β、IL-6等具有促进Th17 分化的能力，而IFN-γ 则具有强烈抑制Th17 产生的作用。在加入抗IFN-γ 抗体的Th17培养中，发现IL-17 的水平升高。动物实验显示，与野生型小鼠相比，IFN-γ 基因敲除的小鼠体内IL-17的分泌量相对较高[7-8]。本研究显示，研究组HLA-B27的检测结果为阳性，ESR 为（32.54±2.24）mm/h，CRP 为（31±9）mg/L；经Spearman 分析发现：研究组Th17 的表达水平与HLA-B27 百分比、HLA-B27平均荧光强度及ESR、CRP 无明显相关性（r=0.415、r=0.151、r=0.086、r=0.289，P均＞0.05），但Th17的表达水平会随着HLA-B27 百分比及HLA-B27 平均荧光强度的增加而升高。原因在于，AS 患者体内存在Th1 严重缺损或Th17 过度表达的情况，抑制了Th1 的分化，导致IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-6 等炎症细胞因子的表达水平增高，促使AS 的发生、发展。

综上所述，AS 患者外周血中Th17、Th2 数目增多，Th1 数目减少，其体内Th 细胞存在失衡情况，提示Th17 参与了AS 整个免疫异常变化的过程且在其中发挥着重要作用。