HPLC法测定邻苯二甲酰亚胺钾盐中的有关物质

陈 刚，甘 常，邱聪慧，陈功政，赵 领，刘泽荣

(1.厅市共建中枢神经系统药物四川省重点实验室，四川 泸州 646100；2.重庆大学生物工程学院，重庆 400030；3.四川科瑞德制药股份有限公司，四川 泸州 646100；4.四川省神经精神类药物制备技术工程研究中心，四川 泸州 646100；5.西南医科大学药学院，四川 泸州 646100)

邻苯二甲酰亚胺钾盐(Phthalimide potassium salt)，是Gabriel法合成胺或氨基酸的原料，可以用作抗抑郁药盐酸米那普仑的关键原料[1].邻苯二甲酰亚胺最早于20世纪50年代与沙利度胺(Thalidomide)一起出现，最初是作为镇静剂进行药物开发[2].邻苯二甲酰亚胺类沙利度胺、来那度胺和泊马度胺(Pomalidomide)在多发性骨髓瘤(MM)中的显著疗效促使人们对邻苯二甲酰亚胺类免疫调节药物的作用机制进行了广泛的研究.2010年，Hiroshi Handa及其同事利用配体亲和色谱法确定沙利度胺的细胞靶点为Cereblon(CRBN)[3].邻苯二甲酰亚胺是合成苯酞、邻苯二腈、靛蓝染料等化学品的原料[4]，邻苯二甲酰亚胺衍生物在杀菌[5，7]、镇痛[6]、抗肿瘤[6，7]等方面展现出潜在的作用.周林峰等[8]研究报道了苯酐中相关杂质的HPLC法，其中提到邻苯二甲酰亚胺的同时测定.高贯威等[9]等研究报道了采用气相色谱-质谱联用法测定茶叶中邻苯二甲酰亚胺.赵立苹[10]等研究报道了采用气相色谱-质谱联用法测定茶叶中灭菌丹和邻苯二甲酰亚胺.也有研究者报道了邻苯二甲酰亚胺及钾盐的合成工艺[11-15]，还没有人报道邻苯二甲酰亚胺钾盐或邻苯二甲酰亚胺的有关物质测定方法.田晓彤等[16]采用替代对照品法测定双嘧达莫片中的6种有关物质，可以作为有关物质定量方法的参考.邻苯二甲酰亚胺钾盐结构中N-K、邻苯二甲酰亚胺结构中N-H非常活泼，易与水、醇反应，采用液相色谱法测定其有关物质时存在较大挑战.因此，有必要建立一种简单、准确、灵敏的方法用于邻苯二甲酰亚胺钾中有关物质的准确测定，以便更好的控制其质量.

图1 邻苯二甲酰亚胺钾及已知杂质化学结构式Fig.1 Chemical structure of phthalimide potassium salt and known impurities

1 实验部分

1.1 仪器与试药

Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，配置二极管阵列检测器(DAD)，Agilent OpenLab CDS网络版工作站；XS105 Du电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；PB-10精密pH计(德国赛多利斯公司).邻苯二甲酰亚胺钾样品由潍坊凯瑞化 工 有 限 公 司 提 供，批 号 为KR20180225-1、KR20181107-1、KR20181121-1、KR20190328-1.邻氨基甲酰基苯甲酸对照品为本公司自制，邻苯二甲酸酐、邻苯二甲酸氢钾工作对照品购自成都科隆化学品有限公司.二甲亚砜、甲醇为HPLC级，其它试剂为分析纯，水为超纯水.

1.2 方法与结果

1.2.1 溶液的制备

取邻苯二甲酸氢钾适量，精密称定，用二甲亚砜溶解并定量稀释制成每1 mL中相当于含邻苯二甲酸4 μg的溶液，作为对照品溶液(0.5%).取邻苯二甲酰亚胺钾(以下简称“样品”)20 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，用二甲亚砜溶解并稀释到刻度，混匀，即得每1ml中含0.8 mg的溶液，作为供试品溶液.

1.2.2 色谱条件及系统适用性

采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-AQ(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)色谱柱，以0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液(含0.1%三乙胺，用磷酸调节pH值至2.0)-甲醇(80∶20)(v/v)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，柱温为25℃；检测波长为233 nm；进样量为10 μL.取样品20 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，先加少量稀释剂溶解，再加入邻苯二甲氢钾对照品溶液1.0 mL(相当于邻苯二甲酸200 μg)，用二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，照上述色谱条件进样测，主峰与相邻杂质峰之间的分离度为5.00，各杂质与相邻色谱峰之间最小分离度为5.99，远大于1.5.

定位溶液色谱图见图2、图3、图4、图5.

图2 空白溶液色谱图Fig.2 HPLC diagram of blank solution

图3 邻氨甲酰苯甲酸对照溶液色谱图Fig.3 HPLC diagram of 2-carbamoylbenzoic acid solution

图4 邻苯二甲酸对照溶液色谱图 Fig.4 HPLC diagram of phthalic acid solution

图5 混合溶液色谱图Fig.5 HPLC diagram of mixed solution

1.2.3 专属性试验

称取20 mg样品，精密称定，置25 mL容量瓶中，用二甲亚砜溶解并稀释到刻度，混匀，制得0.8 mg·mL-1未降解供试品溶液.取样品约50 mg，置扁形称量瓶内，于105℃下放置48 h，取出后放冷，精密称取适量，加二甲亚砜溶解制成每1 mL约含0.8 mg的溶液，作为高温降解溶液.取样品约20 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1盐酸溶液2 mL，常温放置10 min，加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液2 mL中和，再加入二甲亚砜稀释至刻度并溶解，作为酸降解溶液.取样品约20 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液2 mL，放置5 min，加0.1 mol·L-1盐酸溶液2 mL中和，再加入二甲亚砜稀释至刻度并溶解，作为碱降解溶液.取样品约50 mg，置扁形称量瓶内，于光照箱(D65复合光源，4 500±500lx，25℃)内照射48 h，精密称取适量，加二甲亚砜溶解制成每1 mL约含0.8 mg的溶液，作为光降解溶液.取样品约20 mg，精密称定，置25 mL容量瓶瓶中，加入10%过氧化氢溶液2 mL，常温放置1 h，加二甲亚砜溶解并稀释至刻度，作为氧化降解溶液.取上述供试品溶液照“1.2.2”项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图.结果表明:降解杂质与主成分峰分离度≥1.2；主峰纯度因子均大于980；各降解条件下杂质量与主药含量之和除以未降解的初始值，结果均在98%～105%范围之间，质量基本守衡；说明此方法的专属性好.

1.2.4 线性关系考察及杂质校正因子的确定

取邻苯二甲酸氢钾对照品适量，用二甲亚砜溶解并稀 释 制 成 含 邻 苯 二 甲 酸0.8、2.4、4、8、12、16 μg·mL-1的溶液.照“1.2.2”项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图.以峰面积对浓度绘制线性图，回归方程为C＝0.039 4×A-0.002 5；相关系数R为1.000 0，相对截距为0.1%.结果表明，在邻苯二甲酸浓度在0.80～16.12 μg·mL-1范围内与峰面积呈现良好的线性关系，满足定量要求.分别取邻氨基甲酰基苯甲酸、邻苯二甲酰亚胺钾对照品适量，用二甲亚砜溶解并稀释制成含邻氨基甲酰基苯甲酸与邻苯二甲酰亚胺钾分别为0.8、4、8、16、24、40 μg·mL-1的溶液.照“1.2.2”项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图.以峰面积对浓度绘制线性图，邻氨基甲酰基苯甲酸回归方程为C＝0.040 5×A-0.001 5，相关系数R为1.000 0，相对截距为0.0%；邻苯二甲酰亚胺钾回归方程为C＝0.028 0×A＋0.052 0，相关系数R为1.000 0.结果表明，邻氨基甲酰基苯甲酸浓度在0.80～40.03 μg·mL-1，邻苯二甲酰亚胺钾浓度在0.81～40.33 μg·mL-1范围内与峰面积呈现良好的线性关系，满足定量要求.采用斜率法计算各已知杂质的校正因子，结果显示:邻苯二甲酸、邻氨基甲酰基苯甲酸相对邻苯二甲酰亚胺钾的校正因子分别为0.71、0.69.邻苯二甲酸按外标法以峰面积计算，邻氨基甲酰基苯甲酸以邻苯二甲酸为对照，按外标法以峰面积加校正因子计算(相对邻苯二甲酸的校正因子为0.97)，其他单个杂质以邻苯二甲酸为对照，按外标法以峰面积计算，总杂质为所有已知和未知杂质求和.

1.2.5 检测限和定量限试验

分别根据邻苯二甲酸、邻氨基甲酰基苯甲酸、邻苯二甲酰亚胺钾线性与范围下最低浓度对照品溶液信噪比，稀释至信噪比约为10∶1作为定量限浓度，重复进样6次，定量限浓度稀释3倍作为检测限浓度.结果:邻氨基甲酰基苯甲酸、邻苯二甲酸、邻苯二甲酰亚胺钾的定量限浓度分别为0.20、0.27、0.27 μg·mL-1，RSD依次为3.76%、2.63%、2.51%，检测限依次为0.067、0.090、0.090 μg·mL-1.

1.2.6 精密度与重复性试验

由于样品中约含有1%～3%的邻氨基甲酰基苯甲酸，因此仅采用加入邻苯二甲酸(按约0.5%含量加入)来验证方法的精密度和重复性.取样品20 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，先加少量二甲亚砜溶解，再加入邻苯二甲酸氢钾溶液适量(约相当于邻苯二甲酸100 μg)，用二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，作为精密度试验溶液，照“1.2.2”项下色谱条件连续进样6次，计算得邻氨基甲酰基苯甲酸、邻苯二甲酸峰面积的RSD分别为0.10%、0.50%，均小于2.0%，表明精密度良好.按精密度试验方法制备供试品溶液，平行6份，照“1.2.2”项下色谱条件进样测定，邻氨基甲酰基苯甲酸含量RSD为0.80%，邻苯二甲酸含量RSD为3.30%，未知最大杂质和总杂质含量RSD分别为13.2%、1.03%，均小于15.0%，方法的重复性良好(表1).

表1 重复性试验结果(n＝6)Table 1 Results of repeatability(n＝6)

1.2.7 准确度试验

采用邻氨基甲酰基苯甲酸、邻苯二甲酸加标法验证方法的准确度，邻苯二甲酸限度按0.5%、邻氨基甲酰基苯甲酸限度按4%进行验证.取已知杂质含量的样品20 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入邻苯二甲酸与邻氨基甲酰基苯甲酸对照品贮备液使得二者的浓度约为主成分的0.5%和4%，同法配制6份.照“1.2.2”项下色谱条件进样测定，采用外标法计算各供试品中邻苯二甲酸的量以及邻氨基甲酰基苯甲酸的量(均按邻苯二甲酸计)，同时扣除本地值，计算加样回收率.杂质邻苯二甲酸加样回收率为99.53%～100.31%，平均回收率为99.8%，RSD为0.34%(n＝6)，杂质邻氨基甲酰基苯甲酸加样回收率为93.97%～101.43%，平均回收率为96.7%，RSD为2.60%(n＝6)，满足定量要求(见表2、表3).

表2 邻苯二甲酸加样回收率结果(n＝6)Table 2 Test results of Phthalic acid recovery(n＝6)

表3 邻氨基甲酰基苯甲酸加样回收率结果(n＝6)Table 3 Test results of 2-carbamoylbenzoic acid recovery(n＝6)

1.2.8 溶液稳定性

取重复性试验供试品溶液(邻苯二甲酸加标溶液)，常温放置0、12、18 h时，分别按照“1.2.2”项下色谱条件测定，考察供试品溶液的稳定性.结果，在18 h内，总杂质的峰面积与初始值的偏离值为0.2%(＜2.0%)，供试品溶液在18 h内稳定.

1.2.9 样品测定

根据“1.2.1”项下方法制备供试品溶液和对照溶液，按照“1.2.2”项下色谱条件测定.邻苯二甲酸按外标法以峰面积计算，不得过0.5%；邻氨基甲酰基苯甲酸以邻苯二甲酸为对照，按外标法加校正因子以峰面积计算，不得过5.0%；其他单个杂质以邻苯二甲酸为对照，按外标法以峰面积计算，不得过0.5%，总杂质不得大于10.0%；已知杂质和未知杂质的含量之和为总杂质含量(表4).

表4 四批样品有关物质测定结果Table 4 Results of samples

2 讨论与结论

邻苯二甲酰亚胺钾化学结构特殊、反应性强，其在含水条件下极易水解，水解产物邻氨基甲酰基苯甲酸为酸性物质，保留弱，且采用含醇溶剂溶解时易醇解.本研究的核心问题在于解决邻苯二甲酰亚胺钾在测定溶液中稳定性问题及相关杂质的保留和分离问题.本研究以乙腈、四氢呋喃、1，4-二氧六环、乙二醇二甲醚、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇等为溶解溶剂进行了筛选，结果二甲基亚砜为最佳溶剂，最能反映其固形物中杂质含量，避免了待测主成分降解问题，且杂质与主峰都有好的峰形.研究还对比了以甲醇-磷酸盐缓冲液、乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相时待测主成分的稳定性，发现流动相中含有一定比例的甲醇时，主成分未发生醇解，且杂质分离效果更好.

本品以邻苯二甲酸酐和尿素为原料制得，邻苯二甲酸酐在有水存在时迅速水解为邻苯二甲酸，邻氨基甲酰基苯甲酸为本品水解开环的副产物.作者还对本品中可能残留的邻苯二甲酸酐进行了研究，采用相同的色谱条件，样品改用含水量较高的50%二甲亚砜溶液为溶剂，采用邻苯二甲酸外标计算加样供试品中邻苯二甲酸酐的含量及加样回收率.结果，加样供试品中邻苯二甲酸酐已经全部水解为邻苯二甲酸，加样平均回收率为109.6%，RSD为0.83%(n＝6).说明控制本品中邻苯二甲酸总量可以间接控制邻苯二甲酸酐残留量的目的，可以以50%二甲亚砜为溶剂配制供试品溶液单独测定邻苯二甲酸酐的残留量.

在使用液相色谱法定量计算杂质含量时常常用到外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法、标准曲线法等，第二、三种方法本质上也是外标法.理论上，当待测成分浓度与峰面积绘制的标准曲线通过圆点时，即截距为0，才可以在定量浓度范围内使用外标法(外标一点法或者两点法)，否则只能使用标准曲线法或者调整定量浓度范围.在实际含量测定验证中，发现测定过程常常会产生各种误差，待测成浓度与峰面积绘制的标准曲线极少出现通过圆点的情况，即均会产生截距.为了更方便地表示截距的意义，本文以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标绘制标准曲线，定义为峰面积为0时纵坐标的值(浓度值)为截距.在合适的浓度范围，截距通常会趋近于0，相对截距(截距浓度与测定标准浓度或者杂质限度浓度的百分比)在可接受的范围时也可以将标准曲线法简化为外标法.因此，相对截距可以作为一个指标用于评价是否可以使用外标法.通常基于测定方法可接受的误差来确定相对截距的可接受标准.待测物邻苯二甲酰亚胺钾盐本身纯度偏低，有些批次低至约96%，采用自身对照法将产生较大的误差.本文中，邻苯二甲酸相对稳定，对照品易得、纯度高，故优先选用了替代对照品外标法和加校正因子的对照品外标法进行杂质定量计算.

本品水解物和醇解物的确证有待进一步采用液质联用法证明，在流动相中使用一定比例的甲醇时未发生醇解，而供试品中使用甲醇时即发生了醇解，其机理有待进一步研究.

综上所述，本方法准确、简便、专属性强，能有效测定邻苯二甲酰亚胺钾盐的有关物质，对于产品的质量控制具有重大意义.