龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠的滋阴泻火作用研究

李 晗，高云航，宋 玲，施伟东，李玲芝，陈腾飞，侯红平，张广平，叶祖光*

（1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.广西中恒创新医药研究有限公司，广西 南宁 530000）

龟苓膏是我国历史悠久的传统药膳，是经典的药食同源代表方剂。龟苓膏主要以龟甲和茯苓为原料，再配以金银花、蒲公英、甘草等药物精制而成。其性温和，不凉不燥，具有清热祛湿、旺血生肌、止瘙痒、去暗疮、润肠通便、滋阴补肾等功效。龟甲具有良好的滋阴效果，始载于《神农本草经》并被列为上品，《本草纲目》记载其“补心、补肾、补血，皆以养阴也……观龟甲所主诸病，皆属阴虚血弱”［1］。研究表明，龟甲治疗阴虚火旺证不仅可改善临床症状，能减轻化学药物引发的不适反应，提高机体免疫力，改善阴虚证患者的内分泌与血液系统［2］。临床观察发现，阴虚火旺患者血清中的环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷（cAMP/cGMP）比值及皮质醇（Cor）含量上升［3］，超氧化物歧化酶（SOD）与丙二醛（MDA）也呈现一定的变化趋势［4］，并伴随Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶含量上升［5-6］。因此，本实验采用灌胃甲状腺素致阴虚火旺病理模型，对龟苓膏是否通过调节机体的第二信使、能量代谢及氧化应激等途径改善阴虚火旺证进行了初步探讨。

1 实验材料

1.1 动物SPF级健康SD大鼠，雄性，鼠龄8～10周，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。动物饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房，动物使用许可证号：SYXK（京）2015-0041。饲养条件为12 h明暗交替，温度（23±1）℃，湿度（50±15）%，自主饮水及进食。

1.2 药物与试剂 龟苓膏干膏粉（广西梧州双钱实业有限公司，1 g龟苓膏干膏粉相当于5.13 g生药）；左甲状腺素钠片（商品名：优甲乐，每片50 μg，美国默克公司）；cAMP、cGMP ELISA检测试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司）；Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；SOD、MDA与Cor ELISA检测试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器 电子分析天平（德国Sartorius公司）；电子天平（瑞士METTLER公司）；高速离心机（美国Beckman公司）；VICTOR X型多标记酶标仪（美国Perkin Elmer公司）。

2 方 法

2.1 动物分组SD大鼠适应性喂养5 d后，按照体质量随机分为空白组、模型组及龟苓膏低、中、高剂量组，每组10只。

2.2 给药量计算 龟苓膏干膏粉1.4 g能制成200 g的龟苓膏，人每日食用龟苓膏的用量为400 g，则人每日服用剂量为0.047 g干膏粉/kg。本实验设计3个剂量，其中中剂量为人的等效剂量的4倍，换算后大鼠低、中、高剂量分别为：0.66 g干膏粉/kg、1.32 g干膏粉/kg、2.64 g干膏粉/kg，即3.4 g生药/kg、6.8 g生药/kg、13.6 g生药/kg。

2.3 造模与给药 空白组、模型组每天正常饲喂，早上灌胃给予饮用水，给药体积为10 ml/kg；龟苓膏低、中、高剂量组分别按3.4 g生药/kg、6.8 g生药/kg、13.6 g生药/kg的剂量预给药，给药体积为10 ml/kg，连续7 d；第8 d起，模型组和龟苓膏低、中、高剂量组每天上午灌胃150 mg/kg优甲乐混悬液（给药质量浓度为15 mg/ml，给药体积为10 ml/kg），约90 min后龟苓膏低、中、高剂量组再灌胃相应剂量的药物，给药体积为10 ml/kg，连续14 d。末次给药（第21 d）后60 min，以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（用量为3.5 ml/kg），麻醉后腹主动脉取血置于离心管中备用，并剪取大鼠肝脏。

2.4 一般状态观察 每天观察实验期间各组大鼠的精神状态、摄食、活动情况与皮毛色泽，并于第1 d、第7 d、14 d和第21 d称量大鼠体质量，观察大鼠的体质量变化情况。

2.5 大鼠血浆cAMP、cGMP的含量测定 取大鼠全血置于肝素处理过的离心管中，4 000 r/min离心10 min后分离血浆，于-20℃冻存待测。采用酶联免疫法检测cAMP、cGMP的含量，具体操作按照试剂盒说明方法进行。并计算cAMP/cGMP比值。

2.6 大鼠肝脏Na+-K+-ATP酶与Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的测定 称取50～100 mg大鼠肝脏组织，用预冷的PBS冲洗去血渍，滤纸吸干剪碎，随后放入加有钢珠的研磨管内，向研磨管中加入1 ml预冷并含有1% protein K蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，匀浆机进行4 000 r/min匀浆处理后，冰上裂解30 min，以4℃12 000 r/min离心10 min，提取上清后，采用BCA法进行蛋白质含量测定，按照酶联免疫法检测试剂盒说明书检测Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。

2.7 大鼠血清SOD活性及MDA、Cor含量的测定 取大鼠血于离心管中，室温下静置30 min，3 000 r/min离心5 min后取上清液，-20℃保存，按照酶联免疫法检测试剂盒说明书检测大鼠血清SOD活性与MDA、Cor含量。

2.8 统计学分析 采用SPSS Statistics 20统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）的形式表示，组间差异采用单因素方差分析（One-Way-Anova），P＜0.05为有显著性差异。

3 结果

3.1 龟苓膏对阴虚火旺证模型大鼠一般状态及体质量的影响 在龟苓膏低、中、高剂量组预给药期间，大鼠精神状态良好，活泼好动，毛色有光泽，饮水、进食及二便均正常。大鼠灌胃给予优甲乐进行造模后，模型组大鼠前期出现烦躁、拱背扎堆、排泄物增多，后期出现明显消瘦、毛发光泽度差、大便干结等症状。龟苓膏低、中、高剂量组大鼠部分出现烦躁、拱背扎堆情况，整体状态优于模型组。在体质量方面，预给药期间（第1～7 d）各组大鼠体质量均呈现增长趋势，模型组大鼠体质量在造模7 d后（第14 d）时开始出现体质量增长缓慢，在造模14 d后（第21 d），体质量显著低于空白组（P＜0.01）；与模型组比较，龟苓膏高剂量组的大鼠体质量显著增加（P＜0.01），结果见表1。

表1 各组大鼠体质量比较 （g，）

表1 各组大鼠体质量比较 （g，）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01

组 别空白组模型组龟苓膏低剂量组龟苓膏中剂量组龟苓膏高剂量组n 10 10 10 10 10剂量（g生药/kg）- -3.4 6.8 13.6第1 d 249.0±8.0 248.4±8.8 249.6±9.4 249.0±9.2 249.1±9.2第7 d 298.1±10.9 294.0±16.5 294.7±13.1 294.9±10.3 298.3±12.5第14 d 339.8±12.8 322.9±29.9 333.6±20.8 325.8±11.9 335.5±16.5第21 d 385.6±23.0 348.3±30.1①342.6±15.1 354.5±13.0 379.1±23.8②

3.2 龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠血浆cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影响 见表2。与空白组比较，模型组大鼠血浆cAMP含量及cAMP/cGMP比值显著升高（P＜0.01），cGMP含量显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，龟苓膏低、中、高剂量组大鼠血浆中cAMP的含量显著降低（均P＜0.01）；龟苓膏中、高剂量组大鼠血浆中cGMP水平显著增加（P＜0.05或P＜0.01），cAMP/cGMP比值显著降低（P＜0.01）。

表2 龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影响 （）

表2 龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影响 （）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别空白组模型组龟苓膏低剂量组龟苓膏中剂量组龟苓膏高剂量组n 10 10 10 10 10剂量（g生药/kg）- -3.4 6.8 13.6 cAMP（pmol/ml）24.5±2.3 75.2±4.4①65.2±5.8③56.4±2.6③49.3±5.4③cGMP（pmol/ml）12.4±0.8 9.7±1.1①10.1±1.2 11.0±1.4②11.9±1.4③cAMP/cGMP 2.0±0.2 7.9±1.0①6.6±1.0 5.2±0.7③3.4±0.7③

3.3 龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠肝脏中Na+-K+-ATP酶与Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响 见表3。与空白组比较，模型组大鼠肝脏中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，龟苓膏低、中、高剂量组大鼠肝脏中Na+-K+-ATP酶活性显著降低（P＜0.01），Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈降低趋势，但无显著性差异。

表3 龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠肝脏中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响 （）

表3 龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠肝脏中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响 （）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01

组 别空白组模型组龟苓膏低剂量组龟苓膏中剂量组龟苓膏高剂量组n 10 10 10 10 10剂量（g生药/kg）- -3.4 6.8 13.6 Na+-K+-ATP［μmol Pi/（mg·h）］0.94±0.20 1.65±0.11①1.44±0.09②1.34±0.20②1.32±0.18②Ca2+-Mg2+-ATP［μmol Pi/（mg·h）］1.12±0.09 1.69±0.14①1.59±0.15 1.54±0.13 1.50±0.20

3.4 龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠血清SOD活性及MDA、Cor含量的影响 见表4。与空白组比较，模型组大鼠血清中SOD活性显著下降，Cor和MDA含量显著升高（均P＜0.01）。与模型组比较，龟苓膏低、中、高剂量组大鼠血清中SOD活性显著上升（P＜0.05或P＜0.01），龟苓膏中、高剂量组大鼠血清中MDA含量显著下降（P＜0.05或P＜0.01），龟苓膏低、中、高剂量组的大鼠血清中Cor含量有降低趋势，但无显著性差异。

表4 龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠SOD活性及MDA、Cor含量的影响 （）

表4 龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠SOD活性及MDA、Cor含量的影响 （）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别空白组模型组龟苓膏低剂量组龟苓膏中剂量组龟苓膏高剂量组n 10 10 10 10 10剂量（g生药/kg）- -3.4 6.8 13.6 SOD（U/ml）196.8±4.6 121.2±6.0①135.3±10.6②150.5±11.4③163.2±9.7③MDA（ng/ml）116.9±16.2 203.6±26.9①188.0±24.9 180.2±23.6②163.1±22.0③Cor（ng/ml）16.1±2.4 23.2±3.3①19.5±4.7 19.8±6.1 18.8±3.8

4 讨论

阴虚火旺证是临床常见的中医证型，多因机体阴精或津液亏虚而不能制阳，致使阳气亢盛，机体代谢加快，产热增加，从而导致虚热内生的病理状态。

甲状腺素作为能量代谢的重要调节物质，可以增加机体的基础代谢，增加产热，长时间使用甲状腺素可引发形体消瘦、暴躁易怒等现象，这与阴虚火旺体质表现相一致［7-8］。因此，采用甲状腺素建立阴虚火旺模型的方法具有操作简便、成模时间短、重复性好、动物死亡率及成本低等优点，是研究阴虚火旺证的传统造模方法［9］。本实验发现，连续灌胃150 mg/kg优甲乐混悬液14 d后，前期大鼠出现烦躁易怒、拱背扎堆、排泄物增多等现象，后期大鼠出现明显消瘦、毛发光泽度差、大便干结等症状表现，均与阴虚火旺证的临床症状相符，以上结果表明本研究阴虚火旺模型大鼠复制成功。

龟苓膏具有清热解毒、滋阴补肾等功效［10］，其主要有效成分为皂苷、多糖、生物碱、胡萝卜烃类、叶绿素、黄酮、伞花内酯、挥发油、钙、铁、维生素C、维生素B1、β-谷甾醇等［11］。古人认为“龟乃阴中至阴之物”，龟甲性平，不温不凉，是滋阴效果最佳的药物。现代研究也发现，龟甲可降低甲亢阴虚大鼠整体的耗氧量、减缓心率、增加饮水量及尿量。与此同时，龟甲还能提高阴虚证大鼠的抗氧化能力，并调节Bax与Bcl-2等衰老相关因子的蛋白表达［1］。

本研究重点关注与阴虚火旺证密切相关的生理指标，其中包括第二信使cAMP、cGMP的含量及cAMP/cGMP比值的变化，与能量代谢相关的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性以及以SOD活性、MDA含量为代表的氧化应激指标。

有文献报道，机体代谢调节因子cAMP与cGMP是细胞功能的重要调节物质，是生命信息传递的“第二信使”［12］，且机体神经内分泌功能与血中cAMP和cGMP的水平密切相关［13-14］。近年来，国内外学者对中医阴阳理论的物质基础进行了大量的研究与临床观察，发现阴虚火旺证患者神经-肾上腺系统功能偏高，交感神经异常兴奋，cAMP水平升高，cGMP水平降低或维持不变，因此认为选用cAMP/cGMP比值变化进行评价更为准确［15-16］。本实验通过观察大鼠血浆cAMP、cGMP含量与cAMP/cGMP比值，发现阴虚火旺模型组大鼠的血浆cAMP含量及cAMP/cGMP比值显著升高，cGMP含量较空白组显著降低，这与相关文献报道相一致［17-18］。而与模型组比较，龟苓膏低、中、高剂量组大鼠血浆中cAMP的含量显著降低，中、高剂量组龟苓膏组大鼠血浆cGMP水平显著增加，cAMP/cGMP比值显著降低，提示龟苓膏可以通过调节大鼠血浆cAMP、cGMP的含量及cAMP/cGMP比值起到滋阴泻火的作用。

“阴虚则阳亢”，因此阴虚患者临床症状多表现心悸脉数、五心烦热、易于激动，研究发现以上现象的发生可能与能量代谢的增高有关［19-20］。甲状腺素不但能使大鼠产生烦躁易怒等阴虚火旺症状，在细胞水平还可以结合特异性受体，使细胞核RNA聚合酶被激活，增加细胞膜ATP酶的含量，进而使细胞能量代谢速率增加，能量消耗加快，产热增加，体温升高［21-22］。因此，ATP酶活性的检测也成为判断大鼠是否具有阴虚火旺证的代表性指标之一。同时肝脏作为体内最大的实质性脏器，肝脏细胞内Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的改变也会直接影响机体的“热”。本研究发现，模型组大鼠肝脏中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著升高，与模型组比较，龟苓膏低、中、高剂量组的大鼠肝脏中Na+-K+-ATP酶活性显著降低，Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性呈降低趋势。提示龟苓膏可以通过调节大鼠肝脏Na+-K+-ATP酶的活性减轻机体“火旺”的状态。

文献报道显示，阴虚火旺证的病理生理学基础也与体内自由基代谢异常相关，其中“火旺”可能是机体氧化代谢过程增强、自由基生成增多的表现［23］。若不能及时清除，过量的自由基会攻击机体内各种细胞器以及生命大分子物质，进而引发机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的损伤［24-25］。SOD作为清除氧自由基氧化的重要保护酶，能够清除在生理过程中产生的有害物质，有效防止有害物质对组织细胞造成的损伤。MDA为脂质过氧化反应中最具代表性的代谢产物，现代研究多用于对机体自由基代谢水平的衡量［26-27］。本实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠的血清中SOD活性显著下降，MDA含量显著上升，符合阴虚火旺致氧化损伤表现。与模型组比较，龟苓膏低、中、高剂量组的大鼠血清中SOD活性显著上升，龟苓膏中、高剂量组的大鼠血清中MDA含量显著下降。提示龟苓膏可以通过调节SOD活性与MDA含量改善阴虚火旺证。

阴虚火旺证除以烦躁易怒、身形消瘦为主要表现外，还常表现为肾上腺皮质功能亢进［28］。作为一种类固醇类激素，皮质醇主要由肾上腺皮质合成并分泌，其在大鼠体内主要以Cor的形式存在，因此本实验检测大鼠血清中Cor的含量来进一步评价龟苓膏对阴虚火旺模型大鼠的滋阴泻火作用。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠的血清中Cor含量显著升高。与模型组比较，龟苓膏低、中、高剂量组的大鼠血清中Cor含量有所降低，但无显著性差异。

综上所述，龟苓膏作为“药食同源”的代表方剂，能下调cAMP/cGMP比值，降低能量代谢Na+-K+-ATP酶的活性，减慢能量消耗速率，同时通过上调SOD活性、降低MDA含量，进而起到滋阴泻火的作用。本研究为探讨龟苓膏的滋阴泻火作用提供了实验数据，也为在中医药理论指导下“药食同源”食品的合理应用提供科学研究思路。