郑州市育龄期健康女性抗磷脂抗体的分布范围

李爽，崔金全，郭婷婷，归婧，谢林森，杨小风

(1.郑州大学附属郑州中心医院 妇产科，河南 郑州 450000；2.郑州大学第二附属医院 妇产科，河南 郑州 450000)

抗磷脂综合征(anti-phospholipid syndrome，APS)是一种由多种抗磷脂抗体(anti-phospholipid antibody，aPL)介导的非炎症、多系统受累的免疫性疾病[1]，其特征为存在aPL，例如抗心磷脂抗体(anti-cardiolipin antibody，aCL)、抗β2-糖蛋白1抗体(anti-β2-glycoprotein 1 antibody，aβ2GP1)和狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LA)。APS有多种临床表型，复杂多变，包括动静脉血栓的形成以及产科并发症(无法解释的反复发作的早期流产、先兆子痫、早产等)[2]等。参考2010年修订的札幌标准，至少同时满足1条临床标准及1条实验室标准才可明确诊断APS[3]。实验室标准主要评估的是aPL滴度，aPL持续性中高滴度是APS重要的血清学标志。随着研究的深入，发现aPL与多种分类标准外的临床表现有密切关联，并且酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)作为标准推荐的aPL的检测方法，存在标准化缺乏、实验操作影响因素较多、实验室间检测结果变异系数大等缺陷，因此实验室选用重复性高、建立由本地健康志愿者及检测仪器、试剂得到的内部临界值对于临床精准诊断、降低误诊漏诊率至关重要。本研究可使aPL的检测更具有特色和地域化，而非单独参考商品试剂提供的参考阈值，为临床特异性诊断该疾病、提升临床诊治能力提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料随机选取2020年1—12月于郑州大学附属郑州中心医院体检中心进行体检的150名至少已正常分娩过1次的20～40岁志愿者为研究对象。排除标准：存在妊娠并发症、肿瘤、血栓、自身免疫病、不良孕产史、感染等。最终入组120例健康受试者。志愿者均签署知情同意书。本研究经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 仪器与材料选取郑州大学附属郑州中心医院检验科所用的6种商用试剂(INOVA检测试剂盒)，分别是aCL和aβ2GP1的IgA、IgG、IgM亚型，使用全自动化学发光免疫分析仪进行检测。

1.3 检测原理本试验采用化学发光的2步免疫方法。(1)试剂包含包被心磷脂的磁性颗粒，可以捕获样品中aCL。经过孵育、磁性分离和清洗后，加入包含异鲁米诺标记的抗人IgA、IgG、IgM抗体示踪剂，可以结合颗粒上捕获的抗心磷脂IgA、IgG、IgM抗体。再次经过孵育、磁性分离和清洗后，加入激发剂，采用全自动免疫分析仪光学系统以相对光单位(relative light unit，RLU)测定该反应所发的光。RLUs的值与样品中抗心磷脂IgA、IgG、IgM抗体水平成正比。(2)试剂包含包纯化的人抗β2-糖蛋白1的磁性颗粒，可以捕获样品中aβ2GP1。经过孵育、磁性分离和清洗步骤后，加入包含异鲁米诺标记的抗人IgA、IgG、IgM抗体示踪剂，可以结合颗粒上捕获的抗β2-糖蛋白1的IgA、IgG、IgM抗体。再次经过孵育、磁性分离和清洗步骤后，加入激发剂，采用全自动免疫分析仪光学系统以RLU测定该反应所发的光。RLUs的值与样品中抗β2-糖蛋白1的IgA、IgG、IgM抗体水平成正比。

1.4 检测方法取受试者血液5 mL置于无抗凝剂红管中，垂直静置1 h后以3 500 r·min-1离心8 min，检测前由检验科专业医生对全自动化学发光免疫分析仪进行校准及质控，合格后使用仪器按照标准操作流程检测血清aCL和aβ2GP1水平。测量单位为CU。1 CU对应的是16.3 μg·L-1的嵌合参考抗体。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行分析。分别计算aCL和aβ2GP1的IgA、IgG、IgM的第50百分位数、第95百分位数以及第99百分位数。

2 结果

2.1 一般资料120例健康受试者的年龄、体质量指数及籍贯见表1。

表1 健康受试者的一般资料

2.2 aCL及aβ2GP1各型别结果aCL的IgA、IgG、IgM的第99百分位数分别是3.9、20.0、11.0 CU，其中IgA和IgM与厂家截断值有较大差别，IgG与参考值相同。aβ2GP1的IgA、IgG、IgM的第95百分位数分别是4.0、10.6、35.5 CU，与厂家截断值均有明显差别，其中最明显的是IgA，其次是IgM。见表2。

表2 aCL和aβ2GP1的IgA、IgG、IgM的各型别结果及厂家截断值/CU

3 讨论

APS是一种获得性自身免疫性血栓形成性疾病，研究表明该病主要发生在育龄期妇女中，大于50岁的女性发病率仅为12%[4]。APS可分为原发性APS、继发性APS和灾难性APS，其临床表现多样且复杂多变，非孕期的APS患者存在血小板减少、血栓形成、溶血性贫血、心脏瓣膜病变等表现，妊娠合并APS的患者多表现为复发性流产、胎儿生长受限、严重子痫前期、早产等，此类患者又被称为产科抗磷脂综合征(obstetric antiphospholipid syndrome，OAPS)[5-6]。有研究表明，aPL持续阳性的女性发生不良妊娠的概率是正常人群的2～3倍[7]。复发性流产患者中aPL的阳性率可达5%～20%[8]。研究表明中高滴度的aCL水平与孕妇子痫前期的发生呈正相关[9]。因此明确诊断APS，提高诊断敏感性，从而进行有效的治疗对改善患者妊娠结局十分必要。

APS的诊断依赖于患者的临床症状及标准的实验室检查。札幌标准规定诊断APS需要至少1项临床症状和至少1项实验室阳性指标[3](LA阳性；中、高滴度的IgG、IgM型aCL；IgG、IgM型aβ2GP1阳性。以上至少检测到2次，且每次间隔超过12周)。LA检测过程较为烦琐，且对于标本的要求较高，现已较少使用。临床较为常用的为aCL及aβ2GP1。aPL是一组异质性较大的自身抗体，在经典APS及非标准产科APS患者中存在差异，且在系统性红斑狼疮等自身免疫病、恶性肿瘤、感染性疾病甚至部分正常人中也可出现低滴度阳性。有研究表明低滴度的aPL阳性率在一般人群中为1%～5%；在无不良妊娠史的育龄期妇女中约为2%，有复发性流产史的女性中可达到15%[10]。所以使用重复性佳的检测方法建立属于本地实验室的截断值对避免漏诊误诊存在重要意义。

目前，实验室多采用ELISA检测aCL和aβ2GP1水平。标准品及标准化操作缺乏共识导致检测程序标准化较差，实验室间和分析间存在高度差异[11]。现在已有新的方法用于检测aPL水平。化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)目前可用于aPL水平检测。有研究表明CLIA检测aCL及aβ2GP1的灵敏度及特异性比ELISA高，实验操作相对快速简单，并且高度自动化，可减少实验室间变异[12-15]。本研究中所使用的全自动化学发光免疫分析仪已证实与ELISA的诊断性能相当[16]。现在CLIA已逐步应用于国内的实验室。

为了验证厂商提供的截断值是否适用于本地，本研究选取了120名健康且至少已正常生产过1次的女性，采用CLIA方法检测aCL及aβ2GP1的3种亚型，并计算其第99百分位数，可以看出aCL的IgG亚型与厂家截断值基本一致，但IgA与IgM低于厂家截断值，而aβ2GP1的IgM高于厂商截断值，IgG与IgA均低于厂家截断值。这表明厂家截断值并不完全适用于本地。按照此次研究得出的截断值，部分曾无法得到确诊的血清学阴性但临床表现符合APS的患者便可诊断，得到标准内的规范化治疗，极大提高了疾病诊断率，减少临床漏诊误诊，从而为规范化诊疗提供一定的参考。

目前临床诊断APS时，多发现aCL和aβ2GP1的IgG及IgM滴度增高，IgA阳性较少见。但IgA型aCL和aβ2GP1是aPL的重要组成部分，既往已有研究表明其与不良妊娠及血栓形成有关[17]。第13届国际抗磷脂抗体大会的共识表明，检测aCL和aβ2GP1时，优先推荐IgM与IgG亚型，当两者均阴性时检测IgA亚型[3]。目前支持aCL及aβ2GP1的IgA亚型作为APS的诊断标志物的证据主要为回顾性研究数据，且存在一定局限性，如研究人群的异质性、研究设计、使用的检测方法以及阳性临界值等的确定仍存有争议[18]。有研究表明，尽管所有抗体同种型均对APS具有特异性，但aβ2GP1的IgA亚型对APS的特异性优于aβ2GP1的IgM亚型[19]。另有多中心研究(纳入5 892例患者)表明，aβ2GP1的IgA亚型阳性与动静脉血栓以及多种血栓形成的风险增加有关[20]。最近1项针对新型冠状病毒肺炎患者的研究显示，3例脑梗死患者血清中aCL及aβ2GP1的IgA亚型均呈高滴度阳性[21]。本研究结果显示，aCL及aβ2GP1的IgA亚型水平较低，重新定义其截断值或许对明确诊断APS患者有深远意义。

本研究中除aCL的IgG亚型与厂商提供的参考区间基本一致，其余5项指标与其相差较大，可能存在以下原因：检测标本数量较少，实验过程存在误差，部分入组志愿者隐瞒健康状况，人群的异质性等。应扩大志愿者人群，减少误差，得到更准确的数据。临床上表现为APS但aCL及aβ2GP1未达到阳性标准的患者较多，若排除以上因素，是否存在更加具有特异性的指标用于诊断APS值得思考，如抗磷脂酰丝氨酸/抗凝血酶原抗体(anti-phosphatidylserine/prothrombin，aPS/PT)、抗磷脂酰乙醇胺抗体(anti-phosphatidylethanolamine antibodies，aPE)等，已有研究表明这些非标准aPL与血栓形成、产科并发症有较强的相关性[22-23]。有研究显示，同时检测aPS/PT有助于APS的诊断[24]。抗凝治疗不干扰aPS/PT的检测，此项指标很有可能成为LA的替代指标。目前aPS/PT已被纳入APS评分体系中，用于评估个体APS相关血栓风险。

随着医学的进步和科学技术的发展，aPL的检测方法将更加规范化、标准化。在此之前，应根据各地区受众人群、检测方法等的不同建立符合当地特点的参考范围，从而更加准确地诊断APS患者，为提升临床诊治能力提供一定的参考。