鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒双重PCR方法的建立

王新港，王彦辉，周 欣，丁丽萍，陈圆圆，李厚伟，张先锋＊

（河南普华基因科技有限公司，河南 郑州 450002）

鸭2型腺病毒（Duck adenovirus 2，DAdV-2）病和鸭圆环病毒（Duck circovirus，DuCV）病是严重影响我国水禽养殖的两种病毒性疾病。雏鸭阶段两种疾病的发病路和死亡率高。鸭腺病毒感染主要表现为精神萎靡、沉郁和消瘦，排浅黄白色的粪便。病理变化为肝脏肿大并有白色针尖状坏死点灶，肾脏及脾脏肿大充血，胰腺有白色点状坏死。而鸭圆环病毒常呈潜伏感染，并入侵鸭的免疫系统，导致机体的免疫功能下降，对多种条件性病原抵抗力减弱，使其更易遭受其他致病因素的侵袭。而一旦发生混合感染（如鸭流感病毒、鸭腺病毒、鸭大肠杆菌等混合感染），感染鸭的死亡率就会大大提升。目前上述两种疾病已广泛流行于广东、福建、浙江等水禽养殖密集地区，给养鸭业造成了巨大的经济损失。

上述两种病原均为DNA 病毒，引起的临床症状具有一定的相似性，易发生混合感染，极大地增加了临床鉴别诊断的难度。而常规的诊断方法，如动物实验、免疫学和病毒分离培养，在临床诊断中存在诊断时间长、敏感性低以及操作繁琐等缺点，在临床中不易于快速诊断上述两种疾病。因此，建立一种快速、准确、灵敏的检测方法来诊断和监控上述两种病原，确保养鸭业的健康发展尤为重要。

笔者基于前期临床调查和研究的基础上，进行了DAdV-2 和DuCV 双重PCR 方法的建立，并对建立的双重PCR 方法对鸭群中鸭圆环病毒和鸭腺病毒2 型进行鉴别诊断，验证了该方法的可靠性和稳定性。对鸭群中鸭圆环病毒和鸭腺病毒2 型流行病学调查及防控提供了可靠的检测手段，具有重要的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与试剂盒

核酸提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR仪、台式离心机、微量移液器、无菌操作台、电泳仪、凝胶成像仪由河南普华基因科技有限公司提供。

1.2 阳性病料、菌毒株及临床样品

试验用阳性病料：含有鸭圆环病毒的阳性病料由河南普华基因科技有限公司鉴定和保存。

试验用菌毒株：鸭腺病毒2型、鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎Ⅰ型、鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒、鸭细小病毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌均由河南普华基因科技有限公司鉴定和保存。临床样品均来自2019-2020年不同省份送检疑似病料，共计83份。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成

根据GenBank上已报道的DAdV-2和DuCV的全基因组序列，对不同毒株基因组的比对和分析，筛选其较为保守的核酸片段，应用Primer5.0 引物设计软件设计了两对针对上述两种病毒的特异性引物，并通过NCBI（https://www.ncbi.nih.gov/）对两对引物进行在线分析。最终筛选出两对引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。两对引物能够特异性地扩增出598bp（DAdV-2）和297bp（DuCV）的特异性片段。

表1 PCR引物信息序列

1.3.2 菌毒株核酸提取

待测样品核酸的提取：选取疑似发病动物无菌采集其内脏组织（肝脏和脾脏）约5 g，在超净操作台用手术剪刀将上述病料组织剪碎，用PBS按照5∶1（W/V）进行稀释后，放置-80 ℃反复冻融三次，上述待测样品及对照菌毒株按照病毒基因组提取试剂盒（TIANamp Virus DNA/RNA Kit）进行核酸的提取，提取后核酸置-70 ℃保存备用。

1.3.3 双重PCR扩增

在前期单一PCR 研究的基础上将相同浓度的DAdV-2和DuCV DNA混合后作为双重PCR模板，对双重PCR反应条件，包括引物终浓度、反应体积进行优化，以确定最佳反应体系及最佳反应条件。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

1.3.4 双重PCR特异性实验

在双重PCR 扩增优化基础上，采用建立的双重PCR方法分别对鸭病毒性肝炎Ⅰ型、鸭呼肠孤病毒和鸭坦布苏病毒、鸭腺病毒2 型、鸭圆环病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌的阳性模板及ddH2O 进行扩增，同时设阴性对照，验证所建立双PCR方法的特异性。

1.3.5 双重PCR敏感性实验

利用分光光度计分别测定DAdV-2 和DuCV 的DNA浓度，用灭菌双蒸水对其10倍浓度梯度稀释，将各稀释度DNA作为模板进行PCR扩增，检测最小检出量。

1.3.6 双重RT-PCR方法的临床应用

对河南普华基因科技有限公司研发中心于2019-2020年采集的83份疑似病死鸭内脏作为临床检测样品处理后，保存样品核酸，用单一PCR和已经建立的双重PCR方法分别对样品核酸进行检测，通过对两种方法检测结果的比较，来评价建立的双重PCR方法的临床应用效果。

2 结果与分析

2.1 双重PCR的建立

2.1.1 双重PCR反应体系及反应条件优化

在反应条件不变的条件下（94 ℃90 s，94 ℃20 s，54 ℃30 s，72 ℃20 s，30个循环，最后一个循环72 ℃延伸5 min），将相同浓度的DAdV-2 和DuCV 提取的DNA 混合后作为双重PCR模板，对双重PCR反应条件进行优化。

引物浓度筛选：选取20 pmol/μL、10 pmol/μL、5 pmol/μL、1 pmol/μL、0.5 pmol/μL共计5个不同的引物浓度梯度进行PCR扩增，进行引物浓度筛选。

反应体系体积的筛选：在引物浓度为确定条件下，分别选择12.5 μL、25 μL和50 μL的反应体系进行扩增。

考虑到经济性和操作简便性，最终选择的双重PCR反应体系为：2 5BR. BTUFS. JY12.5 μl，两对上、下游引物各0.5 μl（10 pmol/μL），cDNA 模板各1 μl，ddH2O 补足至

25 μL。

2.1.2 双重PCR特异性试验

扩增结果显示，只有DAdV-2和DuCV的混合DNA模板和DAdV-2、DuCV 的单一DNA 模板扩增出与目的片段大小相符的条带。对扩增出的DuCV 病毒的PCR 扩增产物进行基因测序，并对扩增产物序列与参考引物序列进行生物信息学软件分析，两者核苷酸同源性达到96%以上，分析结果证实PCR扩增产物为DuCV病毒。

2.1.3 双重PCR敏感性试验

利用分光光度计分别测定DAdV-2 和DuCV 的DNA浓度分别为67 ng、52 ng，用灭菌双蒸水对其10 倍比梯度稀释，取10-1～10-5稀释度进行检测，将各稀释度DNA作为模板进行PCR 扩增，检测最小检出量。两种病毒DNA 混合物扩增结果表明，该方法对DAdV-2和DuCV的DNA最小检出量分别为0.67 pg和5.2 pg。

2.2 双重PCR临床应用

临床样本检测结果见表2，由表2 可知，本试验双重PCR 检测结果与单一PCR 检测结果的吻合率达到100%。对扩增出DAdV-2的阳性产物进行基因测序，并与参考引物序列进行生物信息学软件分析，两者核苷酸同源性达到98%以上，分析结果证实PCR扩增产物为DAdV-2病毒。

表2 临床样品检测结果

3 讨论

PCR是实验室常用检测方法之一，其具有快速、灵敏、成本低、操作简单等优点；该方法不仅能快速确定病毒种类，还能检测病毒的早期感染和潜伏感染。但是检测时如果使用扩增单种病毒的引物对待测样品进行鉴别，则可能需要准备多份样品扩增多次才能确定感染的病毒类型，不仅在实际操作中需要增加检测次数，另外还会引起交叉感染。双重PCR 是在单一PCR 基础上建立起来的，其优点在于通过一次PCR 的反应，可以同时检测并鉴别两种病原，在临床中具有重要的应用价值。

该试验建立的同时检测DAdV-2 和DuCV 双重PCR方法，通过一系列的试验验证，对DAdV-2和DuCV的核酸最小检出量分别为0.67 pg 和5.2 pg。对临床样品的检出率与单一PCR方法吻合度达到了100%。

该试验建立的同时检测DAdV-2 和DuCV 双重PCR方法具有方便、快捷、敏感、特异性强及可重复性等特点，可大大节省两种病原的检测时间，对PRRSV和GETV的检测、混合感染的诊断、公共卫生及流行病学调查等具有重要学术意义和应用价值。□