不同提取方法下芜菁功能成分及抗氧化活性测定

于翠翠，张文会，陈 锋

（西藏自治区农牧科学院农产品开发与食品科学研究所，西藏 拉萨 850000）

西藏芜菁（Brassica rapa） 是十字花科（Cruciferae） 芸苔属 （Brassica） 二年生草本植物[1]，是藏区特有的高寒低氧的恶劣环境下孕育出来的药、食、饲三用植物[2]。藏医学名著《四部医典》记载，芜菁具有味甘性温、清热解毒、滋补、增氧的功能[3]。藏医使用时常将其根洗净、切片、煎煮浓缩成膏状入药作为抗缺氧的食物。《四川省藏药材标准》记载芜菁块茎中含有丰富的蛋白质、糖类、酸类、矿物质、维生素等[4]。现代研究表明，芜菁功能性组分主要含有多糖类[5]、皂苷类[6]、黄酮[7]、三萜类[8]及有机酸等；具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗疲劳及耐缺氧等功效，为开发芜菁保健食品提供了理论依据[9]。主要探究3 种提取方法下芜菁中总黄酮、总皂苷及三萜类物质含量变化及其抗氧化能力，为后续芜菁开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

芜菁粉，采摘西藏自治区拉萨市；薯蓣皂苷标准品，上海源叶生物科技有限公司提供；芦丁标准品，国药集团化学试剂有限公司提供；齐墩果酸标准品，上海安普实验科技股份有限公司提供；DPPH，梯希爱化成工业发展有限公司提供；总抗氧化能力（T-AOC） 试剂盒，南京建成生物研究所提供；无水乙醇、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶；亚硝酸钠、氯化铝、香草醛、高氯酸、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢等，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅，常州国语仪器制造有限公司产品；酶标仪，北京凯奥科技发展有限公司产品；超声波清洗机，昆山禾创超声仪器有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司产品；紫外分光光度计，上海欣茂仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

芫菁根经清洗、除杂后切片烘干，粉碎过80 目筛，按照下述方法进行提取。

1.3.2 提取方法

①水提法：准确称取芜菁干粉5 g，按1∶30 料液比加入纯水，在50 ℃条件下提取5 h；②超声-醇提法：准确称取芜菁干粉5 g，按1∶30 料液比加入70%乙醇，在超声400 W 条件下65 ℃提取30 min；③酶法：准确称取芜菁干粉5 g，按1∶30 液料比加入纯水，加入由纤维素酶、果胶酶（质量比2∶1），酶添加量为2%，调节pH 值为7 后在50 ℃条件下提取3 h；全部提取液经过滤纸除杂后备用。

1.3.3 芜菁提取液活性物质含量测定

（1） 总黄酮含量测定[10]。准确称取芦丁标准品1 mg，置于10 mL 容量瓶中，加乙醇定容至刻度线，得质量浓度0.1 mg/mL 的芦丁标准液。精确吸取标准品 0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 于 10 mL 离心管中，加入5%亚硝酸钠0.15 mL 混匀放置6 min，加入10%硝酸铝0.15 mL 混匀放置6 min，最后加入4%氢氧化钠2 mL，用乙醇定容至5 mL，在波长510 nm下测定吸光度（OD51）0[11]。以芦丁质量为横坐标（X），以OD510为纵坐标（A），绘制标准曲线，得回归方程为A=6.308 6X+0.006 3，R2=0.997 3；标准曲线在芦丁质量为0.05～0.25 mg 范围内线性关系良好。

取2 mL 芜菁提取液，取按照芦丁标准曲线测定方法测定黄酮类质量浓度，计算黄酮质量浓度，并根据以下公式计算黄酮得率，重复3 次计算平均值。

式中：C——根据标准曲线计算出反应液的黄酮质量浓度，mg/mL；

V——反应液体积；

V2——提取液总体积，mL；

V1——待测液移取的体积，mL；

M——称取的芜菁质量，g。

（2） 总皂苷质量浓度测定[12]。准确称取薯蓣皂苷标准品10 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，得质量浓度0.4 mg/mL 的薯蓣皂苷标准液。精确吸取标准品0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL于1.5 mL 离心管中，水浴65 ℃挥干溶剂后；加入质量分数5%香草醛冰醋酸（新鲜配制） 0.04 mL 和高氯酸0.16 mL，于65 ℃水浴中加热15 min，冷却后加冰醋酸0.5 mL，于波长540 nm处测定吸光度（OD54）0[11]。以薯蓣皂苷质量为横坐标（X），以OD540为纵坐标（A），绘制标准曲线，得回归方程为A=7.759 1X，R2=0.997 5；标准曲线在薯蓣皂苷质量为0.008～0.040 mg 范围内线性关系良好。取芜菁提取液1 mL用无水乙醇稀释至15 mL，取稀释后液体0.1 mL 取按照薯蓣皂苷标准曲线测定方法测定皂苷含量，计算皂苷得率。重复3 次计算平均值。

式中：C——芫根总皂苷质量，g；

M——原料质量，g；

N——提取液稀释倍数。

取芜菁提取液1 mL 用无水乙醇定容至5 mL，取定容后液体0.2 mL 取按照齐墩果酸标准曲线测定方法测定三萜类含量，计算三萜类得率。重复3 次计算平均值。

式中：C——根据标准曲线计算出反应液的三萜质量浓度，mg/mL；

V——反应液体积；

V2——提取液总体积，mL；

V1——待测液移取的体积，mL；

M——称取的芜菁质量，g。

1.3.4 芜菁提取物体外抗氧化活性试验

在国际社会不可再生能源日趋枯竭和节能环保理念愈发深入人心的当下，毕总认为在中国市场中虽然“油改电、锂电化”已推行了一段时间，但进程仍需加快和加深，在叉车和电池技术上有着自己独特优势的比亚迪叉车，仍继续前进，为“油改电、锂电化”做出贡献。

（1） DPPH 自由基清除能力测定[13]。用无水乙醇配制0.1 mml/L DPPH 溶液，样品组：取芜菁提取液1 mL 分别加入DPPH 溶液2 mL，为A1；空白组：取DPPH 溶液2 mL 加入纯水1 mL，为A0；干扰组：取不同浓度芜菁提取液1 mL 分别加入纯水2 mL，为A2；摇匀后在室温条件下避光静置15 min，在波长517 nm 处检测吸光度，计算DPPH 自由基清除率。

（2） 总抗氧化能力测定。采用南京建成生物有限公司试剂盒，按照其方法取提取液0.1 mL 进行总抗氧化能力的测定，并按照公式进行总抗氧能力的计算。

式中：A0——对照OD 值；

A1——测定OD 值。

1.3.5 羟自由基清除能力的测定[14]

在比色管中依次加入浓度为6 mmol/L 的硫酸亚铁溶液2 mL，浓度为6 mmol/L 水杨酸溶液2 mL，浓度为6 mmo/L 过氧化氢溶液2 mL 后摇匀，样品组加入1 mL 提取液，为A1；空白组加入1 mL 纯水代替提取液，为A0；干扰组以2 mL 纯水代替过氧化氢，为A2。

2 结果与分析

2.1 3 种提取方法下活性物质含量测定结果

3 种提取方法下3 种活性物质含量见表1。

表1 3 种提取方法下3 种活性物质含量/ %

由表1 可知，超声- 醇提法下总黄酮含量最高为0.173%，与水法和酶法提取总黄酮含量对比呈现显著性增加；3 种提取方法下芜菁总皂苷含量均存在差异显著性，酶法提取总皂苷含量最高为14.96%，其次超声- 醇提法下芜菁总皂苷含量为11.83%，水提法总皂苷含量最小，为8.93%；3 种提取方法下酶法提取三萜含量最高为7.45%，超声- 醇法提取测定总皂苷和三萜含量为6.05%，这2 种提取方法较水法提取显著性增加。

2.2 3 种提取方法下体外抗氧化活性测定

2.2.1 不同提取方法下DPPH 自由基清除能力测定

不同提取方法下DPPH 自由基清除能力见图1。

由图1 可知，3 种提取方法下提取液对DPPH 自由基清除率均大于90%，水提法提取液对DPPH 自由基清除率最小为90.28%，超声醇提法、酶法提取液对DPPH 自由基清除率分别为94.74%，95.65%，其中酶法提取液对DPPH 自由基清除率最高，3 种提取方法下DPPH 自由基清除率不存在显著性差异。

图1 不同提取方法下DPPH 自由基清除能力

2.2.2 不同提取方法羟基自由基清除能力测定

不同提取方法下羟基自由基清除能力见图2。

图2 不同提取方法下羟基自由基清除能力

由图2 可知，超声- 醇法提取液对羟基自由基清除率最小，为60.37%，水提法、酶法提取液对羟基自由基清除率分别为78.72%，90.40%，水提与醇提2 种方法均与超声- 醇法提取液对羟基自由基清除率存在显著性差异。

2.2.3 不同提取方法下总抗氧化能力测定

不同提取方法下总抗氧化能力见图3。

图3 不同提取方法下总抗氧化能力

由图3 可知，超声- 醇提法提取液总抗氧化能力最高，为11.59 U/mL；水提法、酶法提取液总抗氧化能力分别为7.4 U/mL，9.04 U/mL，超声- 醇提法与水提法总抗氧化能力存在显著性差异，与酶提法总抗氧化能力不存在显著差异。

3 结论

超声- 醇提法总黄酮得率显著性高于其他2 种提取方法，酶法提取测定总皂苷和三萜得率均为最高，且显著高于水法提取；酶法提取对DPPH 自由基清除和羟基自由基清除能力上最强，在对羟基自由基清除能力上与其他2 种提取方法存在显著性差异，在总抗氧化能力上超声- 醇提法显著高于其他2 种提取方法；综上所述，酶法提取可作为提取芜菁较为方便的方法。