新鲜鸡肉中奇异变形杆菌定量PCR 检测与耐药性分析

刘 迎，刘利强，李慧芳，刘 娜，刘彦威，杜 娟

（1. 河北交通职业技术学院，河北 石家庄 050091；2. 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056021）

0 引言

奇异变形杆菌（Proteus mirabilis） 是好氧兼性厌氧菌，属于肠杆菌科（Proteobacteriaceae） 变形杆菌属（Proteobacteriaceae） 细菌，呈G+，广泛分布于生活用水、土壤、人和动物体内，是一种机会致病菌[1]。奇异变形杆菌除了可以引起人和动物发生败血症等疾病以外，也能够通过加热不彻底的食物进入人体，引发食物中毒。食物中奇异变形杆菌的污染率为3.8%～100.0%，以动物源食品带菌率较高，特别是新鲜肉，在全国已屡次发生消费者食用被奇异变形杆菌污染的食品引发食物中毒的事件[2]。

荧光定量PCR 技术是针对细菌高度保守序列设计引物，进行PCR 扩增，具有结果稳定、灵敏度高、污染小、重复性好、标准化操作等特点，已用于食品中致病菌的检测[3]。但目前国内关于荧光定量PCR方法检测新鲜鸡肉中奇异变形杆菌的研究比较少见。近年来，由于抗生素在食品动物中的不规范使用，奇异变形杆菌耐药性已广泛传播，但不同来源的菌株耐药性却大不相同，目前还未见新鲜鸡肉源奇异变形杆菌耐药性报道[4]。为此，建立荧光定量PCR 检测方法对河北省某地市场现售新鲜鸡肉奇异变形杆菌污染进行检测，并对新鲜鸡肉中分离到的菌株进行耐药性分析，了解本地流行株的耐药特性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

LB 肉汤、SS 琼脂培养基、MHA 琼脂培养基、细菌基因组DNA 提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司提供；荧光定量PCR 仪，美国Bio-Rad 公司提供；Oxoid 药物敏感性试验纸片：分别为四环素（TCY）、强力霉素（DOX）、青霉素（PEN）、阿莫西林（AMX）、氨苄西林（AMP）、氯霉素（CHL）、链霉素（STR）、卡那霉素（KAN）、庆大霉素（GEN）、壮观霉素（SPT）、甲氧苄氨嘧啶（TMP）、磺胺甲恶唑（SMZ）、诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）、红霉素（ERY）、林可霉素（LIN）、克林霉素（CLI），共17 种，均为Oxiod Ltd Basingstoke Hampshire England 公司提供；药敏质控菌株为ATCC 25922 大肠埃希菌，中国科学院微生物所菌种保藏中心提供。

1.2 引物种类

细菌通用引物16S rDNA：上游引物F：5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'，下游引物R：5'-GAGTT TGATCMTGGCTCAG-3'，扩增产物预期大小为750 bp。奇异变形杆菌的尿素酶基因内转录间隔区序列（CP034090） ， 上 游 引 物 为 qrrA-F:5， -TTTATCAAAGCCTCAAACCC-3， 下 游 引 物 为 qrrA-R:5，-TGCGTCACCCTCTAACTCATC-3，扩增产物预期大小为395 bp。细菌通用引物16S rDNA 和奇异变形杆菌qrrA 特异性引物由奥美德诺（北京） 基因科技有限公司合成。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集

在河北省某农贸市场用无菌棉签涂抹新鲜鸡肉表面，然后放入无菌离心管中并作标记，低温送回实验室，共计100 份样品。

1.3.2 细菌分离

将采集的鸡肉样品在SS 琼脂上进行划线分离，于37 ℃下恒温培养24 h。观察菌落大小、颜色、形态、边缘整齐度和光滑度等细菌菌落特征。挑取可疑变形杆菌的菌落进行革兰氏染色后在显微镜下观察。

1.3.3 奇异变形杆菌鉴定

奇异变形杆菌采用分子生物学的鉴定方法，即利用细菌16S rDNA 通用引物进行PCR 扩增，对PCR 产物进行测序分析。挑取SS 琼脂上疑似奇异变形杆菌单菌落，按照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明提取奇异变形杆菌DNA，进行PCR，扩增产物送生工生物工程（上海） 股份有限公司进行基因测序。对测到的序列结果登录https://www.ncbi.nlm.nih.gov/在线BLAST，进行同源性比对，比对结果相似大于97%以上的即可确定为奇异变形杆菌。奇异变形杆菌PCR 反应采用 25 μL 体系。

奇异变形杆菌PCR 反应体系见表1。

表1 奇异变形杆菌PCR 反应体系/μL

PCR 扩增反应程序：预变性94 ℃-5 min；变性94 ℃-40 s，退火 60 ℃-30 s；延伸 72 ℃-55 s，共35 个循环；再72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。

1.3.4 奇异变形杆菌荧光定量PCR 的建立

（1） qPCR 扩增。①荧光定量PCR 反应体系为SYBR Premix Ex Taq（2×） 12.5 μL，上游引物 F1、下游引物下游引物F2分别加入1 μL，加入Proteus DNA 模板 1.0 μL，再加入灭菌的双蒸水补足反应体系，共25 μL。②qPCR 反应条件为预变性、变性、退火、延伸的温度和时间分别为94 ℃-4 min，94 ℃-15 s，56 ℃-35 s，72 ℃-30 s，反应 40 个循环（cycle），再72 ℃-10 min 延伸，保存于4 ℃，然后进行统计和分析。

（2） 标准曲线的绘制。奇异变形杆菌在LB 肉汤增菌培养，用营养琼脂平板涂布法测定分离到的奇异变形杆菌菌液浓度。用LB 肉汤稀释最后调整奇异变形杆菌浓度为106CFU/mL 后提取奇异变形杆菌DNA，将106CFU/mL 奇异变形杆菌菌液的DNA以10x倍比系列用无菌双蒸水进行稀释至相当于101CFU/mL 奇异变形杆菌菌液的DNA。经qPCR 扩增后，以奇异变形杆菌菌液浓度（CFU/mL） 为横坐标，以PCR 反应的循环数（Ct 值） 为纵坐标绘制浓度标准曲线。

（3） 特异性试验。奇异变形杆菌和鸡肉中常见的7 种常见致病菌为对照菌株，分别为沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肠球菌 （Enterococcus）、链球菌 （Streptococcus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae） 的基因组DNA 为模板进行荧光定量PCR，检测构建方法的特异性。

（4） 敏感性试验。以鸡肉中奇异变形杆菌qPCR反应和普通PCR 反应分析比较，检测所构建qPCR方法的敏感性，以101～106CFU/mL 奇异变形杆菌DNA 6 个浓度梯度分别进行普通PCR 和qPCR 扩增，以2 种方法所能检测到最低浓度来比较敏感性的差异。

（5） 重复性试验。从鸡肉中分离到奇异变形杆菌为出发点，在不同浓度DNA 梯度中随机选择2 个浓度梯度，每个浓度分别为3 个重复，对构建方法的重复性进行检验，根据奇异变形杆qPCR 反应的Ct 值计算2 个浓度组之间变异系数（CV/%），检查奇异变形杆菌qPCR 检测方法稳定性。

（6） 组织样品检测。将在市场采集的新鲜鸡肉样品用无菌棉签进行涂抹后，置于LB 培养液中培养1 h，按照试剂盒操作说明提取DNA，设定阳性和阴性对照样品，用所构建的荧光定量PCR 方法对采集的鸡肉新鲜样品检测，根据的Ct 值计算鸡肉中奇异变形杆菌数量，评价所构建方法的实用性。

1.3.5 药物敏感性检测

按WHO 推荐的K-B 纸片法进行奇异变形杆菌的抗菌药物敏感性分析。挑取SS 琼脂上生长并用分子生物学方法鉴定为奇异变形杆菌的菌株接种于LB肉汤培养摇菌（180 r/min） 培养6～8 h，调整菌液含量为108CFU/mL。吸取100 μL 菌液涂布于MHA 琼脂培养基，用无菌镊子将药敏纸片轻轻置于培养基表面，稍按压使药敏片与培养基结合紧密，置于37 ℃恒温培养箱中，18～24 h 进行培养后测量药敏片抑菌圈直径。根据美国临床试验室标准委员会（CLS，2006） 最新颁布的抗微生物药物敏感性试验标准判定奇异变形杆菌对选用的17 种抗生素的耐药结果。

2 结果与分析

2.1 奇异变形杆菌的分离

在100 份样品中，有68 份样品在SS 琼脂上长有疑似奇异变形杆菌的菌落，特征为表面光滑，圆形、扁平、中等大小、中心呈黑色。染色后镜检显示菌体革兰阴性菌，多数为杆状、两端钝圆，少部分为丝状。

2.2 分子生物学鉴定

样品经PCR 扩增、测序，基因比对，结果表明此次在68 份疑似变形杆菌中鉴定出66 株奇异变形杆菌，其分离率为66.0%。

2.3 奇异变形杆菌荧光定量PCR 的检测

2.3.1 奇异变形杆菌引物的特异性

奇异变形杆菌经尿素酶qrrA 特异性引物PCR 扩增后，琼脂糖凝胶电泳形成一单条带，片段约为395 bp，与设计引物的预期基因片段大小相同。经基因测序、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov） 比对，所扩增序列与基因库奇异变形杆菌尿素酶基因的相似度为99.91%。

2.3.2 定量PCR 特异性

经定量PCR 扩增后形成单一扩增曲线和熔解曲线，而沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢菌、阴沟肠杆菌都没有扩增曲线和熔解曲线，说明该方法能够区分奇异变形杆菌和鸡肉其他中常见的治病菌。

荧光定量PCR 结果见图1。

2.3 .3 敏感性试验

以奇异变形杆菌DNA 相当于菌液106～101CFU/mL的6 个菌落总数用普通PCR 检测、qPCR 分别上机测定，结果发现定量PCR 方法可以检测到1×101CFU/mL（图2），常规PCR 检测到1×103CFU/mL（图3），结果显示荧光定量PCR 的敏感度比常规PCR 高100 倍。

奇异变形杆菌qPCR 扩增曲线见图2，奇异变形杆菌DNA 6 个菌落总数PCR 电泳见图3。

图2 奇异变形杆菌qPCR 扩增曲线

图3 奇异变形杆菌DNA 6 个菌落总数PCR 电泳

2.3.4 重复性试验结果

将106CFU/mL 奇异变形杆菌提取DNA 后，随机选择了106和1042 个菌落总数，用SYBR Green I荧光定量PCR 进行了3 次扩增，根据反应后的Ct 值计算组内变异系数（CV%），Ct 值的变异系数分别为1.3%，0.9%，均比2%低，证明构建的奇异变形杆菌检测方法稳定性较好。结果显示，扩增曲线和熔解曲线在相同菌落总数的3 个重复基本一致（图4）。

奇异变形杆菌荧光定量PCR 变异系数见表2，荧光定量PCR 重复性试验结果见图4。

表2 奇异变形杆菌荧光定量PCR 变异系数

图4 荧光定量PCR 重复性试验结果

2.3.5 荧光定量PCR 检测

用无菌棉签在新鲜鸡肉表面进行涂抹后及时置于无菌LB 肉汤离心管中，于37 ℃下培养1 h 后按照试剂盒说明提取新鲜鸡肉DNA，加入PCR 反应体系中进行扩增检测，检测呈阳性样品有Ct 值，呈阴性样品对照无Ct 值，所采集的100 份新鲜鸡肉中有66 份（66.0%） 检出了奇异变形杆菌。

样品检测结果见图5。

图5 样品检测结果

2.4 奇异变形杆菌耐药性结果

根据CLSI 标准判定，在新鲜鸡肉分离的66 株奇异变形杆菌对养殖中常用的17 种抗生素均有不同程度的耐药，其中对链霉素、红霉素、林可霉素、克林霉素100%耐药，对青霉素耐药率较低，为19.7%（13/66）。奇异变形杆菌表现为多重耐药性，最低为四重耐药，共6 株；最高为九重耐药，共3 株；此外，五重耐药菌7 株，六重耐药菌19 株，七重耐药菌26 株，八重耐药菌5 株。

66 株奇异变形杆菌对17 种抗生素的敏感性结果见表3。

表3 66 株奇异变形杆菌对17 种抗生素的敏感性结果

3 结论

奇异变形杆菌（Proteus mirabilis） 是肉类食品常见的污染菌之一，常常通过消毒不彻底的肉食品进入人体，引起食物中毒。目前，国内因奇异变形杆菌引起的家庭性食物中毒呈逐年增加趋势，对消费者的健康造成很大的伤害，对经济造成很大的损失。为此必须加强新鲜肉类食品的检测，以保证消费者的食品安全。目前，国家还未制定相应的国家标准[5]，常用的检测方法是传统的微生物检测包括奇异变形杆菌的分离培养、生化鉴定等方法，这些方法具有很高准确度但操作起来繁琐，不适合日常食品卫生检测工作，急需建立一种实用、准确、高效的检测方法，荧光定量PCR 检测方法时间短、高通量、特异性强，实现了对致病菌的检测，可用于对新鲜鸡肉样品的检测。

张海霞等人[6]研究发现奇异变形杆菌与鸡肉中常见的沙门氏菌有交叉抗原，用血清学方法检测容易出现交叉凝集，发生漏检或错检。该研究建立的定量PCR 方法可以区分奇异变形杆菌和沙门氏菌，防止假阳性的出现，可以用于新鲜鸡肉样品的检测。食品特别是新鲜肉类食品受到奇异变形杆菌的污染情况较为严重，陈善娇等人[7]对中山市某市场出售的268 份新鲜肉类食品中采用普通PCR 检出了117 份样品携带奇异变形杆菌，总携带率为43.7%，其中新鲜鸡肉携带率最高，阳性率为51.6%。郭玉梅等人[8]通过菌株分离、生化鉴定的方法在154 份熟肉制品中鉴定出30 份（19.5%） 奇异变形杆菌阳性样品。毕水莲等人[9]对奇异变形杆菌标准菌株采用普通PCR和qPCR 2 种检测方法相比，普通PCR 和荧光定量PCR 对检测结果具有一致性，但是相对于传统细菌培养的检测周期长、要求高的不足，荧光定量PCR完成检测的时间为2～3 h，奇异变形杆菌荧光定量PCR 检测方法能够大大节省时间。王慧[10]采用普通PCR方法检测鸡源奇异变形杆菌敏感度为104CFU/mL，该研究中常规PCR 检测限为103CFU/mL 和定量PCR检测限为101CFU/mL，定量PCR 方法比常规PCR 方法灵敏度高100 倍，具有高灵敏度的优点。

奇异变形杆菌耐药性相对严重，菌体本身携带耐药性R 质粒能够在同种属不同菌株甚至不同种属的细菌之间进行转移，并形成复合R 质粒，导致菌体抵御抗菌药物的进化加快，耐药性增加[11]。何欣怡等人[12]对鸡源奇异变形杆菌的耐药性研究中发现株菌对红霉素、四环素耐药率为100%（7/7）。梁紫璐等人[13]对临床分离的奇异变形杆菌耐药性结果表明，菌株对红霉素的耐药率为97.4%（75/77），对四环素的耐药率为72.73%（56/77）。孙冷宁等人[14]对来源于市场所售鲜肉的奇异变形杆菌耐药性分析也表明，奇异变形杆菌对链霉素等18 种抗菌药物的耐药性较为严重，其中对链霉素、红霉素耐药率为100%（71/71），对四环素类药物多西环素的耐药率为80.3%（57/71）。该研究中分离到的66 株奇异变形杆菌对红霉素耐药情况相似，对四环素类耐药性有差异，但总体上耐药率较高，可能与样品来源或区域不同有关。该研究中分离的奇异变形杆菌共66 株，数量相对较少，耐药性分析结果不能全面反映奇异变形杆菌的耐药情况，但从现有的数据分析表明，奇异变形杆菌的总体耐药性较为严重，需要相关部门多加关注。

有研究表明，新鲜鸡肉中奇异变形杆菌的污染较为严重，存在食品安全风险，且奇异变形杆菌耐药率较高。因此，首先要加强食品特别是生鲜肉类食品中奇异变形杆菌的监测，防止食品污染，减少食物中毒现象；其次要根据本地区奇异变形杆菌流行株引起的食物中毒菌株耐药特征，选择合理的药物，减少盲目治疗；最后建议消费者学习健康知识，食物彻底加热，防止交叉污染，提高食源性疾病的防范意识。