急性心肌梗死患者血浆外泌体miR-21-3p/PTEN/AKT表达水平及诊断价值研究

刘 蕾，赵 鹏，张 军，刑雪梅，马晨曦，孙鹏雀（1.汉中市三二〇一医院a.医学检验科；b.内分泌与风湿免疫科，陕西汉中 73000；.西安大兴医院心血管内科，西安 71000）

根据中国心血管疾病统计发现，近年来中国急性 心 肌 梗 死（acute myocardial infarction, AMI）发病率逐渐增高，死亡率整体呈上升趋势，严重影响中老年人的生活质量[1]。目前关于AMI的病因和发病机制尚不明确，有研究报道，外泌体作为细胞间遗传信息交换的重要媒介，与动脉粥样硬化、心力衰竭和心肌梗死等心血管疾病的发生密切相关[2]。其中微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是外泌体中数量最多的生物活性成分之一，可通过靶向mRNA在基因转录和调控中发挥作用，从而参与机体的多种生理病理过程[3]。有大量研究表明，miR-21在肺癌、胃癌、肾癌等多种恶性肿瘤中表达上调，且miR-21模拟物可以促进肿瘤细胞生长，加快迁移和侵袭，增强化学或放射抗性，具有潜在的临床应用价值[4-6]。还有研究证实miR-21在心肌梗死患者血浆中高表达，且与患者冠脉病变程度及心肌损伤程度有关[7]。此外，蛋白酪氨酸酶基因/丝苏氨酸激酶（PTEN/AKT）途径作为生物体内重要的生存信号通路，受到miR-21的靶向调控，进而调节细胞周期、肿瘤生长、血管生成等[8]。那么miR-21是否可以通过调控PTEN/ AKT通路在AMI疾病发生发展中发挥作用呢? 本研究主要通过检测AMI患者血浆外泌体中miR-21-3p，PTEN和AKT的表达水平，进而深入探讨其对AMI诊断价值，为AMI的早期筛查及预后判断提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年2月～ 2021年8月于陕西省汉中市三二〇一医院内分泌与风湿免疫科住院并诊断为急性心肌梗死的120例患者作为AMI组，其中男性68例，女性52例，年龄65～75（70.35±5.62）岁，平均身高169.55±7.24cm，BMI指数为27.20±1.68kg/m2。另选取同期在我科住院，经冠脉造影发现冠脉无明显狭窄患者120例为对照组，其中男性63例，女性57例，年龄63～75（71.16±5.18）岁，平 均 身 高170.12±6.80cm，BMI指数26.56±2.01kg/m2。两组研究对象在性别、年龄、身高、BMI指数比较中差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

纳入标准：① 经临床表现和组织病理学诊断，确诊为心肌梗死患者；②具有缺血性胸痛症状，且持续胸痛时间超过 30 min；③心电图表现为病理性Q波的形成；④入院后均进行经皮冠状动脉介入治疗；⑤本研究经本院伦理委员会审核批准后进行，所有研究对象均知情并签署同意书。排除标准:①患有心肌炎、急性心包炎、主动脉夹层等其他类型心脏疾病者；②并发其他恶性肿瘤者；③患有自身免疫病者；④并发有心、肾、肝等严重功能器官损伤者。

1.2 仪器与试剂 exoRNeasy Kit 试剂盒（德国Qiagen公司）；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；miRNAs引物（上海生工生物工程公司合成）；PTEN， AKT多克隆抗体（Cell signaling technology公司）；KH19A型离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；CFX96荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 血浆外泌体提取及鉴定：分别采集AMI患者和对照组的空腹外周静脉血加入装有肝素钠的抗凝管，2 000 r/min，4℃离心10 min后，将淡黄色血浆转移至无RNA酶离心管，根据exoRNeasy Kit试剂盒步骤提取血浆外泌体，取10 µl 纯化好的外泌体滴于2 mm的载样铜网上，静置1 min后，滴加pH 6.8 的3g/dl磷钨酸溶液室温负染5 min，用双蒸水轻轻润洗两边后，室温晾干，透射电子显微镜下观察其形态并拍照，通过Western blot法检测外泌体特征性蛋白CD9，CD63和CD81的表达进行验证。

1.3.2 qRT-PCR检测血浆外泌体中miR-21-3p表达：依照RNA提取试剂盒说明书提取血浆外泌体中总RNA，并在紫外分光光度计下检测其纯度，A260/A280比值为1.8～2.0时说明RNA纯度较高。根据反转录试剂盒合成第一链cDNA，反应条件：65℃ 5 min（RNA变性），25℃ 5 min（退火），42℃ 30 min（反转录酶工作温度），85℃ 5 min（逆转录酶失活）；用逆转录合成的cDNA作为模板进行RT-PCR扩增，扩增体系为25 µl，实时PCR条件：94℃ 5 min（预变性），94℃ 40 s（变性），40℃ 40 s（退火），72℃ 1 min（延伸），循环35次进行扩增，72℃，10min，4℃保存备用；最后采用荧光定量PCR仪进行检测，以U6作为内参，根据RT-PCR反应结果中的Ct值，采用2-ΔΔCt相对定量的方法计算。引物序列miR-21-3p正向引 物5'-GTCGAGCGTCGCACGT-3'，反 向 引 物5'-GCCGGTACGTTATCACAGTGT-3'，U6正 向 引物5'-CTAACTGATACTGCGCTAGCA-3'，反向引物5'-TGCGACCGACGACAATGAA-3'。

1.3.3 Western blot检 测 血 浆 外 泌 体 中PTEN和AKT表达：根据蛋白提取试剂盒操作步骤提取血浆外泌体总蛋白，并将蛋白浓度调整至同一浓度。将调整后的蛋白样品加入loading buffer，混匀后沸水浴10 min，在室温下放凉后2 000 r/min离心10 min即可往胶孔中上样。电泳条件为：浓缩胶 80 V，待条带跑至分离胶时电压调整为120 V，电泳结束后轻轻取出胶，冰上转硝酸纤维素膜（NC膜）2 h，10g/dl 脱脂奶粉室温封闭60 min，PBST轻轻润洗三次，加入按比例稀释好的一抗4 ℃孵育过夜，回收一抗后PBST洗膜三次，加入二抗，室温孵育2h，PBST漂洗三次后即可在暗室进行显影，凝胶成像仪观察拍照，并用Image-J 软件分析各组蛋白相对表达。

1.4 统计学分析 应用SPSS22.0分析数据，计量资料符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，相关性分析用Pearson法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆外泌体鉴定 见图1。透射电镜观察到，血浆外泌体呈双层膜的泡状结构，Western blot结果显示，外泌体特征蛋白CD9，CD63和CD81在上清液中表达较低，而在外泌体中表达较高，说明血浆外泌体提取成功。

图1 血清外泌体鉴定

2.2 血浆外泌体中miR-21-3p，PTEN和AKT表达水平 见表1。本研究分别采用qRT-PCR和Western blot检 测 了 血 浆 外 泌 体 中miR-21-3p，PTEN和AKT表达水平，结果显示，与对照组相比，AMI患者的miR-21-3p和AKT表达显著上升，而PTEN表达水平显著下降，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 两组患者血浆外泌体中miR-21-3p，PTEN和AKT表达水平比较（±s）

表1 两组患者血浆外泌体中miR-21-3p，PTEN和AKT表达水平比较（±s）

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2.3 AMI患者血浆外泌体中miR-21-3p，PTEN与AKT之间的相关性分析 Pearson相关性分析显示，AMI患者血浆外泌体中miR-21-3p与PTEN呈明显负相关（r=-0.440，P=0.000），PTEN与AKT呈明显负相关（r=-0.674，P=0.000），差异有统计学意义（P＜0.05），而miR-21-3p和AKT之间无显著相关性，差异无统计学意义（r=-0.072，P=0.438）。

2.4 血浆外泌体miR-21-3p，PTEN与AKT表达对AMI诊断价值比较 见表2，图2。ROC曲线结果显示，单独检测时，外泌体miR-21-3p，PTEN,AKT水平对应AUC分别为0.805，0.782，0.720，三者联合检测时AUC为0.885，联合检测比单独检测具有更高的诊断价值，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 外泌体miR-21-3p，PTEN与AKT单独检测和联合检测ROC曲线参数比较（%）

图2 外泌体miR-21-3p，PTEN与AKT单独检测和联合检测的ROC曲线

3 讨论

心肌梗死是心血管疾病中最严重的一大类疾病，梗死后的心肌细胞不可逆转，会降低心室收缩性，继而进展为心衰，严重威胁患者的生命健康[9]。因此，寻找具有诊断价值的靶向因子来提高心肌梗死患者的生存率，改善其不良预后具有十分重要的临床意义。近年来已有大量研究证实，由双层膜包裹的外泌体是低免疫原性的，在各种生理条件下相对稳定，可以在体内循环，并且能够穿过血脑屏障为受体细胞提供蛋白质，RNA及miRNA等，在心血管疾病的发生发展中发挥了重要作用[10]。WANG等[11]研究发现心脏祖细胞来源的外泌体miRNA-210是一种重要的缺氧相关miRNA，具有抑制心肌细胞凋亡、促进血管生成、改善心脏功能等重要的心脏保护作用，可能是预测或诊断相关心血管疾病的有用生物标志物。KHAN等[12]研究发现，胚胎干细胞来源的外泌体miR-294能诱导心肌保护反应，促进心肌梗死后胚胎干细胞的存活和增殖，具有心脏再生能力以及调节心脏中基于心肌细胞的修复功能。HOU等[13]研究发现运动来源的循环外泌体miR-342-5p可以通过靶向Caspase-9和JNK-2抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡，还可以通过靶向磷酸酶基因Ppm1f增强其存活信号，进而起到内源性心脏保护作用。然而关于血浆来源的外泌体miRNA在心血管疾病中的研究还相对较少，因此，本研究主要检测了血浆外泌体miR-21-3p在心肌梗死患者中的表达水平。

有大量研究表明，外泌体miR-21作为微小RNA家族成员，参与了血管生成、心肌纤维化、心肌细胞凋亡及动脉粥样硬化等多种病理机制的调控[14]。LIU等[15]研究发现，外泌体miR-21可以激活AKT和ERK1/2通路，进而增加了HIF-1α和VEGF的表达，进一步诱导肿瘤血管化及血管生成。ZHOU等[16]发现 miR-21通过靶向Jagged1促进心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化和心肌纤维化，提示miR-21 和Jagged1 是心肌纤维化的潜在治疗靶点。CHEN等[17]研究表明，敲低miR-21表达，对心肌细胞抗氧化应激、增强成纤维细胞活化和促进内皮细胞血管生成的保护作用也随之降低，并且增加AMI大鼠心肌梗死面积和免疫细胞浸润。TELKOPARAN等[18]研究表明，动脉粥样硬化患者循环中miR-21表达显著低于健康对照组，可能调节动脉粥样硬化斑块的进展，可作为诊断和随访动脉粥样硬化相关心血管疾病的生物标志物。基于上述文献报道，外泌体miR-21在不同疾病中的表达水平也不尽相同，本研究结果表明，血浆外泌体miR-21-3p在AMI患者中表达显著上升，对AMI具有一定的诊断价值。

PTEN是具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，既往研究显示多种miRNAs (miR-21，miR-143，miR-199a-3p等)可以靶向作用PTEN进而调控AKT途径影响到肿瘤细胞增殖、侵袭及凋亡，对肿瘤的发生发展起到重要作用[19]。YU等[20]发现，LncRNA H19通过miR-21/PTEN/Akt轴抑制气道平滑肌细胞增殖和迁移，可能成为治疗气道平滑肌细胞增生的潜在生物标志物。WU等[21]研究表明，抑制miR-21表达可以负向调控PTEN基因的表达，进而抑制AKT活化，为食管癌的临床治疗提供了新方法。PAN等[22]研究发现，尿酸以浓度和时间依赖性方式抑制miR-2的表达，并且miR-21可通过靶向调节PTEN/AKT/eNOS 轴增加心肌细胞凋亡，提示miR-21/PI3K/Akt/eNOS轴的中断可作为心肌缺血/再灌注损伤的新治疗策略。本研究通过Pearson相关分析发现，血浆外泌体miR-21-3p与PTEN呈明显负相关，PTEN与AKT亦呈负相关，三者之间可能具有单向调控关系，与前期文献报道相吻合。

综上所述，AMI患者血浆外泌体中miR-21-3p表达上升，其与PTEN呈负相关，PTEN又负向调控AKT表达，三项指标均可作为辅助诊断AMI的潜在标志物，且联合检测对AMI有较高的诊断价值。但本研究还存在一定的局限性，后期可检测血清中miR-21/PTEN/AKT的表达及调控关系，也可结合动物实验，进一步证实外泌体miR-21/PTEN/AKT在心肌梗死动物中的表达，为本研究提供更有力的实验依据。