急性冠脉综合征患者血清miR-361-5p和COMP表达水平及其与短期预后的相关性研究

周 倩, 陈 诚,陈智龙（.鄂东医疗集团黄石市中心医院/湖北理工学院附属医院老年病科，

湖北黄石 435002；2.黄石市中医院心血管内科，湖北黄石 435099）

急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是冠心病常见类型，临床表现包括不稳定性心绞痛（unstable angina，UA）和急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），目前对ACS发病机制了解有限，相关ACS早期筛查和预后评估标志物较少。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）斑块不稳定破裂或表面侵蚀引起的血栓形成是ACS发生发展的重要原因，目前研究证实，血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VEC）功能障碍、血管平滑肌细胞增殖和向动脉内膜迁移在AS斑块发生和破裂中发挥关键作用[1-2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类小的非编码单链RNA，参与多种细胞因子转录调控，可作为包括ACS在内的心血管疾病患者的诊断和预后评估的生物标志物[3-4]。研究指出，miR-361-5p能通过调节内皮细胞活性发挥抗血管生成作用[5]。且研究报道抑制miR-361-5p能恢复血管内皮生长因子表达，改善小鼠缺血四肢的血流量[6]。然而关于miR-361-5p与ACS的关系尚不清楚。软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）是肌肉骨骼中的一种基质蛋白，主要由血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）表 达，能维持VSMC的稳态[7]。研究指出，血清COMP水平与冠心病和维持性血液透析患者冠状动脉钙化有关[8-9]。但关于miR-361-5p，COMP与ACS的关系却缺乏研究报道。本研究旨在分析ACS患者血清miR-361-5p，COMP表达水平，评价二者在ACS筛查和近期预后中的应用价值，以期为开发ACS相关生物标志物提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2020年1月～2021年1月鄂东医疗集团黄石市中心医院收治的170例ACS患者为ACS组，均依据《急性冠脉综合征急诊快速诊治指南（2019）》[10]诊断，其中男性123例，女性47例；年龄38～86（64.51±12.09）岁，体质指数19～32（24.05±2.82）kg/m2；病史：92例高血压，44例糖尿病，99例高脂血症；疾病类型：81例UA，38例ST段抬高型心肌梗死（ST elevation myocardial infarction，STEMI），51例 非ST段抬高型心肌梗死（non-ST elevation myocardial infarction，NSTEMI）；KILLIP分级[11]：Ⅰ级27例，Ⅱ级132例，Ⅲ级9例，Ⅳ级2例。纳入标准：①符合ACS诊断标准；②年龄≥18岁；③患者及家属均知情研究；④临床资料完整者。排除标准：①既往血管旁路手术治疗或PCI史者；②近期接受外科手术治疗者；③不能接受随访者；④并发恶性肿瘤者；⑤肝、肾等重要脏器功能损害者；⑥先天性心脏病者；⑦并发免疫系统疾病、血液系统疾病者。另选取同期66例体检健康者为对照组，经冠状动脉造影证实无冠状动脉狭窄，其中男性48例，女性18例；年龄27～82（62.58±10.87）岁，体质指数19～27（23.75±2.74）kg/m2。排除自身免疫性疾病、急慢性传染病、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤者。两组基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：BS-280），彩色多普勒超声诊断仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：DC-N2S），酶标仪（赛默飞Multiskan™ FC），Trizol总RNA抽提试剂盒（浙江简石生物技术有限公司，货号：TR205-50），Takara逆转录试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司，货号：6215A），RT-PCR试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：RP1100），COMP试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，货号：ZN2113-GKP）。

1.3 方法

1.3.1 基础资料收集：收集ACS患者基础资料，包括性别、年龄、体质指数[体重（kg）/身高（cm）2]、吸烟史（≥1支/天，连续≥6个月）、病史、发病至就诊时间、疾病类型、病变支数、KILLIP分级、血压、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerols，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、住院用药，彩色多普勒超声诊断仪行心脏彩超测定入院后6h内左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.3.2 血清miR-361-5p，COMP水平检测：采集ACS组入院时和对照组体检时静脉血，3 000r/min离心10 min（8cm），取上清液置于-80℃冰箱中待检，72h内完成检测。取出部分血清标本使用Trizol总RNA抽提试剂盒提取血清总RNA，紫外分光光度计验证纯度，使A260nm/A280nm为1.8～2.0，Takara逆转录试剂盒合成cDNA，进行qRT-PCR扩增。miR-361-5p正向引物：5'-ATAAAGTGCTGAC AGTGCAGATAGTG-3'，反向引物：5'-TCAAGTAC CCACAGTGCGGT-3'；内参U6正向引物：5'-CTCG CTTCGGCAGCAGCACATATA-3'，反向引物：5'-AA ATATGGAACGCTTCACGA-3'。反应体系（共10.0 μl）：5.0μl SYBR Premix Ex Taq；0.2μl上 游 引物；0.2μl下游引物；0.2μl ROX Reference Dye；1.0μl cDNA模 板；3.4μl RNase-free ddH2O。反应条件：95℃ 90s（1个循环），95℃ 30s，63℃30s，72℃ 15s（40个循环），反应结束后得到各反应管Ct，血清miR-361-5p相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。部分血清标本使用ELISA测定血清COMP水平，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 冠状动脉造影：ACS患者选用飞利浦FD20血管造影机行冠脉造影，常规穿刺股动脉或桡动脉，多角度和多体位照射血管，左、右冠状动脉至少投照5个与2个体位，采用Gensini积分[12]评价冠状动脉狭窄程度，冠脉狭窄程度计分：狭窄＜25%（1分），25%～＜50%（2分），50%～＜75%（4分），75%～＜90%（8分），90%～＜99%（16分），99%～100%（32分）。病变部位计分：小分支（0.5分），右冠状动脉、左回旋支中或远段、左前降支远段（各1分），左前降支中段（1.5分），左前降支或回旋支近段（2.5分），左主干（5分）。冠状动脉狭窄程度=冠脉狭窄程度计分×病变部位计分，总积分为所有病变积分之和。根据Gensini积分将ACS患者分为重度狭窄组（≥41分，n=41）、中度狭窄组（18～＜41分，n=78）、轻度狭窄组（0～＜18分，n=51）。

1.3.4 随访：对ACS患者随访3个月，统计主要 不 良 心 血 管 事 件（major adverse cardiovascular events，MACE）发生情况，包括支架内血栓形成、再发心绞痛、血运重建、再发心肌梗死、全因死亡等。3个月内发生MACE定义为短期预后不良，根据是否发生MACE分为MACE组（n=23）和非MACE组（n=147）。

1.4 统计学分析 选用SPSS26.0统计学软件，计数资料以n（%）表示，χ2或Fisher检验；计量资料正态分布以均数±标准差（±s）表示，两组间t检验，多组间单因素方差分析，组间两两比较Bonferroni校正；偏态分布以M（P25, P75）表示，两组间U检验，多组间H检验，组间两两比较Bonferroni校正；Pearson相关性分析ACS患者血 清miR-361-5p，COMP水 平 与Gensini评 分 的相关性；多因素Logistic回归分析ACS患者预后不良影响因素受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清miR-361-5p，COMP水平对ACS发病和短期预后的预测价值，曲 线 下 面 积（area under the curve，AUC）采 用Hanley & McNeil检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACS组与对照组血清miR-361-5p，COMP水平比较 ACS组血清miR-361-5p，COMP水平分别为0.58±0.21，143.64±25.23ng/ml，对照组分别为0.33±0.18，112.35±19.09ng/ml，ACS组 血 清miR-361-5p，COMP水平明显高于对照组，差异有统计学意义（t=8.625，10.277，均P＜0.001）。

2.2 不同冠脉病变程度ACS患者血清miR-361-5p，COMP水平比较及与Gensini评分的相关性 见图1。轻度、中度、重度狭窄组血清miR-361-5p（0.34±0.11，0.63±0.15，0.76±0.12），COMP水平[118.01（108.29,125.52）ng/ml, 147.71（134.72,158.63）ng/ml, 162.32（158.74, 177.71)]依次升高，差异均有统计学意义（F=131.941,H=101.001，均P＜0.001）；重度狭窄组、中度狭窄组与轻度 狭 窄 组 比 较（t=17.510，12.688；U=7.848，8.382），重度狭窄组与中度狭窄组比较（t=5.046，U=5.077），差异均有统计学意义（均P＜0.001）。ACS组Gensini评分为（37.34±11.71）分，Pearson相关性分析显示，ACS患者血清miR-361-5p，COMP水平与Gensini评分呈正相关（r=0.765，0.755，均P＜0.001）。

图1 ACS患者血清miR-361-5p，COMP水平与Gensini评分的相关性

2.3 血清miR-361-5p，COMP水平单独及联合诊断对ACS发病的预测价值 见表1和图2。ROC曲线显示，miR-361-5p＋COMP联合诊断ACS发病的AUC显著大于miR-361-5p，COMP单独检测，差异有统计学意义（Z=4.684，4.573，均P＜0.001）。

表1 血清miR-361-5p，COMP水平单独及联合检测对ACS发病的预测价值

图2 血清miR-361-5p，COMP水平单独及联合预测ACS发病的ROC曲线

2.4 ACS患者短期预后不良影响因素的单因素分析 见表2。170例ACS患者3个月内MACE发生率为13.53%（23/170），其中1例心源性死亡，3例支架内血栓形成，9例再发UA，5例血运重建，5例再发心肌梗死。单因素分析显示，MACE组年龄、体质指数明显大于非MACE组，发病至就诊时间明显长于非MACE组，LVEF明显低于非MACE组，血清miR-361-5p，COMP水平明显高于非MACE组，差异有统计学意义（t=4.271，4.979，均P＜0.05）。

表2 ACS患者短期预后不良影响因素的单因素分析[n（%），M（P25，P75）]

2.5 ACS患者短期预后不良影响因素的多因素Logistic回归分析 见表3。以年龄、体质指数、发病至就诊时间、LVEF，miR-361-5p，COMP为自变量，短期预后为因变量（发生MACE=1，未发生MACE=0），多因素Logistic回归分析显示，调整其他混杂因素后，miR-361-5p，COMP是ACS患者短期预后不良的独立影响因素（P＜0.05）。

表3 ACS患者短期预后不良影响因素的多因素Logistic回归分析

2.6 血清miR-361-5p，COMP水平单独及联合诊断对ACS患者短期预后不良的预测价值 见表4和图3。ROC曲线显示，miR-361-5p＋COMP联合预测ACS患者短期预后不良的AUC显著大于miR-361-5p，COMP单独预测，差异有统计学意义（Z=2.494，2.617，P=0.013，0.001）。

图3 血清miR-361-5p，COMP水平单独及联合预测ACS患者短期预后不良的ROC曲线

表4 血清miR-361-5p，COMP水平单独及联合检测对ACS患者短期预后不良的预测价值

3 讨论

急性冠脉综合征（ACS）是冠状动脉内不稳定的AS斑块破裂或糜烂继发血栓形成所致的心脏急性缺血综合征，目前我国包括ACS在内的心血管病患者人数达3.30亿，已成为城乡居民死亡的主要原因[13]。虽然近年来ACS的诊断和治疗取得了长足进展，但早期再灌注率仍然较低，我国仅有约1/3的STRMI患者在指南规定的时间内得到有效再灌注，省级、地市级、县级STEMI 患者院内病死率分别为3.1%，5.3%，10.2%[14]。且再灌注患者仍然有较大几率出现不良结局，ACS患者出院后1年总冠状动脉时间发生率和2年内死亡率分别为12.5%，5.2%[15-16]。因此研究ACS发生发展的关键分子通路，对ACS早期诊断和促进预后改善具有重要意义。

血管内皮细胞（VEC）功能障碍是AS发生的始动因素，目前一些研究指出可溶性血管细胞黏附分子、P选择素等可反映VEC功能障碍的分子能作为评估ACS发生和进展的指标[17-18]。因此探索VEC功能相关分子与ACS的关系有望发现潜在的生物标记物。miRNAs是一类由19～24个核苷酸组成的内源性单链非蛋白质编码RNA，通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区的碱基互补结合调节靶基因功能，参与VEC功能调节[19]。miR-361-5p定位于人染色体Xq21.2，既往研究多报道其与肿瘤的关系[20]。近期WANG等[21]在绝经后骨质疏松症中研究发现，miR-361-5p能靶向血管内皮生长因子调节血管生成。这项研究表明，miR-361-5p参与调节VEC功能。本研究结果显示，ACS组血清miR-361-5p水平表达上调，且随着冠状动脉病变程度加重而进一步升高，说明miR-361-5p参与ACS发生和发展，其机制可能与miR-361-5p能靶向抑制血管内皮生长因子和内皮祖细胞活性导致VEC功能障碍有关。血管内皮生长因子是调节VEC增殖、分裂、移动等行为的重要糖蛋白，能通过维持VEC功能和内膜完整性抑制AS形成，内皮祖细胞是VEC前体细胞，参与血管发生和损伤后修复，其活性降低是VEC功能障碍的重要原因[22]。WANG等[6]研究显示，miR-361-5p能抑制血管内皮细胞表达和内皮祖细胞活性，敲除miR-361-5p能恢复血管内皮生长因子表达和内皮祖细胞活性。

胶原纤维、弹性蛋白等细胞外基质是组成AS斑块和斑块纤维帽的重要部分，AS形成过程中VSMC自中膜向内膜迁移，由收缩表型转化为合成表型，可生成大量细胞外基质，因此迁移是斑块形成和破裂的重要原因是一种五聚体细胞外基质糖蛋白，能刺激软骨细胞增殖和软骨形成，近年研究发现VSMC也能分泌COMP，具有抑制VSMC表型转化作用，当VSMC中COMP浓度降低时，VSMC可由收缩表型转化为合成表型，由此推测COMP可能参与AS形成[23-24]。近期SANDSTEDT等[25]报道了颈动脉狭窄的脑卒中患者血液中COMP表达上调。本研究结果显示，ACS组血清COMP水平表达上调，且随着冠状动脉病变程度加重而进一步升高，说明COMP参与ACS发生和发展，分析与ACS过程中COMP过度降解，导致外周血COMP浓度升高有关。COMP作为一种细胞外基质糖蛋白，AS发展过程中，中层VSMC向内膜迁移时需要穿越致密的细胞外基质，而细胞外基质降解有利于VSMC迁移，因此血管中膜、粥样斑块、粥样硬化损伤处能检测到大量降解细胞外基质的基质金属蛋白酶[26]。所以我们推测当COMP在细胞外基质中过度降解时，外周血COMP浓度升高，COMP作用降低，导致VSMC转化为合成表型，这也解释了为什么血清COMP水平升高与ACS发生和发展有关。但目前相关机制报道较少，其参与ACS的机制还需进一步研究。MACE是ACS患者残疾和死亡的重要原因，我们研究结果显示，在调整其他混杂因素后，miR-361-5p，COMP仍然能独立影响ACS患者短期预后，说明miR-361-5p，COMP还可能成为ACS短期预后不良评估指标。ROC曲线分析表明，血清miR-361-5p，COMP水平均可作为ACS发病和短期预后不良的预测指标，且二者联合预测的AUC显著增加，说明联合检测血清miR-361-5p，COMP水平有助于更好预测ACS发病和短期预后。

综上所述，ACS患者血清miR-361-5p，COMP水平升高，与冠状动脉狭窄程度密切相关，可作为ACS发病和短期预后不良的预测指标。但目前尚不完全明确miR-361-5p，COMP参与ACS发生发展的机制，同时本研究为单中心小样本研究，随访时间较短，还需多中心大样本研究证实。