硒代4-叔丁基杯[4]芳烃的合成及体外抗氧化活性研究

＊李学丽 胡青青 冯德日

（沈阳医学院 辽宁 110034）

谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是体内一种非常重要的抗氧化酶，其可以有效的清除活性氧自由基（ROS），防止组织细胞内的脂质过氧化和衰老现象[1-2]。GPX酶活性中心的催化基团主要是硒代半胱氨酸（Se-Cys）基团，特别是金属硒（-Se）基团的催化作用对于GPX的抗氧化活性非常关键。目前，已有多项临床研究表明，人体内GPX活性的下降及缺失与心脑血管疾病、克山病及多种肿瘤疾病的发生密切相关[3-5]。

4-叔丁基杯[4]芳烃是由苯酚单元通过亚甲基在酚羟基邻位连接而成的环状小分子聚合物。由于其具有分子量小、包含多个活性基团而更易于进行多种化学修饰等特点，4-叔丁基杯[4]芳烃目前已成为继环糊精和冠醚之后广受瞩目的第三代有机合成超分子[6,7]。在4-叔丁基杯[4]芳烃的空间结构中，其内部具有一个由4个苯酚单元所围成的疏水腔结构，该结构类似于催化酶活性中心的底物结合部位结构，非常有利于其作为模拟酶与多种酶的催化底物相结合的作用。同时其4个苯酚单元的结构下缘都各有1个羟基（-OH）活性基团，可以进行多种化学修饰，引入各种模拟酶的催化基团。

在我们的研究中，我们以4-叔丁基杯[4]芳烃疏水腔结构下缘苯酚单元的-OH基团为修饰靶点，在其结构中引入了GPX酶的关键催化基团-金属硒（-Se），首次合成了一种新的GPX模拟物—硒代4-叔丁基杯[4]芳烃，合成路线见图1。此外，我们还建立了由Fe2+/Vc诱导的牛心线粒体损伤体系，对硒代4-叔丁基杯[4]芳烃的体外抗氧化GPX活性进行了进一步的研究[8-10]。

图1 硒代4-叔丁基杯[4]芳烃的合成路线

1.实验部分

(1)试剂与仪器

①试剂。4-叔丁基杯[4]芳烃、对甲苯磺酰氯（p-TsCl）、硼氢化钠（NaBH4）、硫代巴比妥酸、抗坏血酸购自为国药集团公司，硒（Se）、谷胱甘肽（GSH）、辅酶（NADPH）、谷胱甘肽还原酶（RD）购自Sigma公司产品，其它均为国产分析纯试剂直接使用。

②仪器。Bruker-300型核磁共振仪，Agilent 7890A-5975C型ESI-MS质谱仪（甲醇为溶剂），UV-3100型紫外-可见光分光光度计，KH22R型高速冷冻离心机。

(2)硒代4-叔丁基杯[4]芳烃的制备与纯化

①化合物2的合成

在三口烧瓶中，将2.0g 4-叔丁基杯[4]芳烃溶于40mL DCM溶液中，加入1.2mL三乙胺后，0℃滴加P-TsCl的乙腈溶液（2.5g/5mL）。室温搅拌反应12h后，蒸出大部分溶剂，向残留物中加入30mL氯仿和1M的稀盐酸，搅拌10min，加入碳酸氢钠溶液水洗有机相至pH为中性，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，蒸出大部分的氯仿，加入甲醇，有白色沉淀生成，过滤，沉淀用甲醇重结晶，得到2.42g白色粉末，产率为83%，mp176.0～177.4℃；1HNMR（CDCl3，400MHz）δ:7.56（bs，2H，OH），7.22（s，4H，ArH），6.88（b s，8 H，A r H），6.7 2（s，4 H，A r H），4.2 6（d，4H，ArCH2Ar），3.28（d，4H，ArCH2Ar），1.56（s，6H，ArCH3），1.30［s，18H，C（CH3）3］，0.99［s，18H，C（CH3）3］；ESI-MS，m/z:956.32[M+HI+]。

②化合物3的合成

用文献[5]方法制备NaHSe后，将100mg化合物2溶解于20mL DMF/H2O（V:V=1:1）中，在高纯氮气保护下加入2mL 1mol/L NaHSe，60℃搅拌反应36h。反应结束后用DCM萃取反应液并保留有机相，有机相再依次用水和饱和食盐水萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，得淡黄色油状物83mg，产品进一步经硅胶柱层析纯化，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯（V:V=5:1），最终得淡黄色固体57mg，产率72%，mp157.2～158.5℃；1HNMR（CDCl3，400MHz）δ:7.65（bs，2H，OH），7.25（s，4H，ArH），6.75～6.80（s，4H，ArH），4.28（d，4H，ArCH2Ar），3.29（d，4H，ArCH2Ar），1.32［s，18H，C（CH3）3］，0.95［s，18H，C（CH3）3］；ESI-MS，m/z:774.23[M+HI+］。

(3)硒代4-叔丁基杯[4]芳烃GPX活力的测定

我们采用文献[2]GPX活性的标准测定方法对模拟物硒代4-叔丁基杯[4]芳烃的GPX活性进行测定，并将该模拟物的GPX活性分别与天然GPX酶及其他几种GPX模拟物的GPX活性进行比较。其中每分钟每消耗1μmol/L NADPH所需要模拟物的量定义为一个GPX酶活力单位。

(4)硒代4-叔丁基杯[4]芳烃抗体外线粒体氧化损伤活性的测定

①建立由Fe2+/Vc诱导的体外牛心线粒体损伤评价体系。我们首先在体外制备多种不同的由Fe2+/Vc诱导的牛心线粒体损伤评价体系：在20ml pH7.4的磷酸钾缓冲溶液中，分别加入氯化钾（0.125mol/L）、氯化镁（0.001mol/L）、谷氨酸钠（0.005mol/L）、谷胱甘肽（1μmol/L）、牛心线粒体（0.5mg/ml）以及不同质量浓度的模拟物硒代4-叔丁基杯[4]芳烃（质量浓度分别为0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L），37℃保温30min，然后分别向各反应体系中加入Vc（0.0005mol/L）和FeSO4（12.5μmol/L）试剂诱导线粒体损伤反应。其中，不加入Vc和FeSO4诱导的线粒体损伤体系为空白对照组，在加入Vc和FeSO4诱导的线粒体损伤体系中模拟物浓度为0μmol/L的体系为损伤组，模拟物浓度分别为1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L的体系为模拟物抗氧化保护组。

②损伤线粒体膜膨胀度的测定。分别测定各损伤体系中线粒体膨胀度的变化值，参考文献[9]。

③丙二醛生成量的测定。分别测定各损伤体系中线粒体脂质过氧化反应的终产物-丙二醛（MDA）生成量，参考文献[9]。

④细胞色素C氧化酶活力值的测定。参考文献[10]的方法，分别测定各损伤体系中的细胞色素C氧化酶（CCO）活性值的变化。

2.结果和讨论

(1)硒代4-叔丁基杯[4]芳烃与其他几种GPX模拟物的活性比较

经测定，硒代4-叔丁基杯[4]芳烃的GPX活力达到了137.22U/μmol，虽然其GPX活力与天然GPX酶的5780U/umol酶活力值仍有不小的差距，但在与其他已合成的GPX模拟物的活性比较中，硒代4-叔丁基杯[4]芳烃的GPX活性明显增强，结果见表1。

表1 不同GPX模拟物的酶活性比较

(2)硒代4-叔丁基杯[4]芳烃对线粒体氧化损伤的保护作用

①硒代4-叔丁基杯[4]芳烃可以抑制损伤线粒体外膜的膨胀。线粒体在遭受氧化损伤的过程中，最明显的变化是其线粒体外膜会发生明显的膨胀现象，从而导致整个线粒体损伤体系的浑浊度升高，光吸收能力下降。从图2中我们可以发现，加入模拟物硒代4-叔丁基杯[4]芳烃后的线粒体损伤体系保护组与损伤组相比，其线粒体外膜的膨胀现象明显减弱，且随着模拟物硒代4-叔丁基杯[4]芳烃浓度的增加，其对于损伤线粒体外膜膨胀的抑制作用越来越显著。在4μmol/L硒代4-叔丁基杯[4]芳烃的保护组中，20min后，其线粒体外膜膨胀度的增长率仅为损伤组的28%。

图2 不同浓度硒代4-叔丁基杯[4]芳烃对损伤线粒体膨胀抑制作用的活性比较

②硒代4-叔丁基杯[4]芳烃可以抑制损伤线粒体中丙二醛的生成。在线粒体遭受氧化损伤的过程中，大量线粒体外膜中的脂类物质会发生明显的脂质过氧化现象，丙二醛（MDA）是线粒体脂质过氧化反应的终产物。从图3中我们可以明显的发现，加入模拟物硒代4-叔丁基杯[4]芳烃后的线粒体损伤体系保护组可以明显的抑制线粒体中MDA的生成，且保护组中模拟物的浓度越高，则抑制线粒体中MDA生成的能力越明显，这也就意味着硒代4-叔丁基杯[4]芳烃可以有效的抑制损伤线粒体中脂质过氧化现象的发生。

图3 不同浓度硒代4-叔丁基杯[4]芳烃对损伤线粒体MDA生成抑制作用的活性比较

③硒代4-叔丁基杯[4]芳烃可以保护损伤线粒体中细胞色素C氧化酶的活性。我们的实验结果见图4，我们将没有加入Vc和FeSO4诱导的线粒体反应体系做为空白对照组，定义其CCO酶活力为100%。在此基础上我们发现，损伤组中线粒体CCO酶活力值随着损伤时间的延长，其CCO活力下降非常明显，60min后其CCO活力仅为空白对照组的43%。而相应的，在加入模拟物硒代4-叔丁基杯[4]芳烃后的线粒体损伤体系保护组中我们可以发现，不同浓度的模拟物都可以对损伤线粒体中CCO活力值的降低起到一定的抑制作用，且模拟物浓度越高，则其对线粒体CCO活力的保护作用越明显。

图4 不同浓度硒代4-叔丁基杯[4]芳烃对损伤线粒体CCO活力保护作用的活性比较

3.结论

我们基于4-叔丁基杯[4]芳烃的结构特点，在其具有GPX底物结合部位所需的疏水腔结构的基础上，以其结构下缘苯酚单元中的-OH基团为修饰靶点，将GPX酶关键催化基团-金属硒（-Se）基团引入到其结构中，首次合成了一种新的GPX模拟物-硒代4-叔丁基杯[4]芳烃，目前该模拟物结构还未见其他文献报道。按照标准的Wilson酶活力测定方法，我们测定该模拟物的GPX抗氧化活性达到了137.22U/μmol，与目前已合成的几种GPX模拟物相比，其GPX活性得到了比较明显的提高。同时，在该模拟物体外抗氧化活性的评价实验中我们还发现，模拟物硒代4-叔丁基杯[4]芳烃对于由Vc/FeSO4诱导的线粒体氧化损伤现象具有明显的抑制作用。其能够有效的减少损伤线粒体外膜的膨胀破裂现象，抑制损伤线粒体中脂质过氧化产物MDA的累积，并维持损伤线粒体中CCO酶活力的稳定。这些实验结果都充分表明，模拟物硒代4-叔丁基杯[4]芳烃具有良好的GPX抗氧化生物学活性。