染色体核型分析联合CNV-seq在NT增厚胎儿产前诊断中的应用

胡艳平，袁静，李琴，周培，程龙凤

胎儿颈项透明层（nuchal translucency，NT）指胎 儿颈后部皮下组织内液体集聚的厚度；孕11～13+6周NT增厚是早期筛查胎儿染色体非整倍体的重要指标。传统染色体核型分析无法检出5～10 Mb以下的染色体微缺失/微重复，随着拷贝数变异测序（copy number variation sequencing，CNV-seq）在产前诊断中的应用，我国专家共识建议对有介入性产前诊断指征或需求的孕妇，在其充分知情的前提下，可将CNV-seq作为一线的产前诊断方法供其选择[1]。安徽医科大学第一附属医院（我院）产前诊断中心以NT≥2.5 mm为界值，采用染色体核型分析联合CNV-seq技术，探讨其在NT增厚胎儿中的应用。

1 对象与方法

1.1 对象及分组选择2020年1月—2021年10月就诊于我院孕11～13+6周NT≥2.5 mm的单胎孕妇189例。根据是否合并其他介入产前诊断指征（高龄、血清学异常、超声异常等）分为单纯NT增厚组（119例）和非单纯NT增厚组（70例）。根据NT厚度分为2.5 mm≤NT＜3.5 mm组（123例）和NT≥3.5mm组（66例）。孕妇及家属充分知情选择并签署知情同意书。

1.2 实验室方法孕16～24周在超声引导下行羊膜腔穿刺术，抽取羊水21～23 mL，其中16～18 mL羊水进行G显带染色体核型分析，5 mL羊水用于CNV-seq检测。

1.2.1 染色体核型分析采用原位细胞培养法，常规进行细胞培养、收获、制片和G显带、全自动扫描仪扫描、拍照，按照人类细胞遗传学国际命名体制参照ISCN（2020）标准进行染色体核型分析。

1.2.2 CNV-seq方法患者羊水标本进行离心沉淀，取羊水中胎儿脱落细胞提取DNA，构建测序文库并进行质控，通过HiSeq 2000测序平台进行CNV-seq检测。将染色体全基因组测序检测到的基因组CNV，参照国际基因组CNV多态性数据库Decipher、UCSC Genome Browser、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、International Standards for Cytogenomic Arrays（ISCA）等以及相关文献评估CNV-seq结果是否有致病性，并附上相关文献。检测报告严格按照2019年中国低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识[1]进行CNV-seq分级，CNV-seq结果有5个等级：致病性、可能致病性、临床意义不明、可能良性及良性。

1.3 统计学方法应用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。定性资料用率表示，组间比较用χ2检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

189例NT增厚的胎儿中染色体核型检出异常31例（检出率16.40%），包括非整倍体24例（12.70%）和结构异常7例（3.70%）；CNV-seq检出致病性拷贝数变异（pathogenic copy number variations，pCNVs）38例（20.11%），其中非整倍体24例（12.70%），其他pCNVs 14例（7.41%），包括微缺失/微重复综合征10例（5.29%）和染色体片段缺失/重复4例（2.12%）。CNVseq在158例染色体核型正常者中额外检出pCNVs 9例（5.70%）。

2.1 染色体核型分析24例非整倍体中21-三体16例、18-三体5例、Turner综合征3例，分别占染色体核型异常的51.61%（16/31）、16.13%（5/31）和9.68%（3/31）。7例染色体结构异常中46,XX,t(11:15)(q14:q26)dup(11)(q14q25)、46,XY,der(8)、46,XX,?der(15),del(18)、46,XY,del(13)(q14,q34)、46,XY,dup(4)(q27q35)del(4)(p16)各1例，2例46，XX，inv(9)(p12q13)。染色体多态性8例。

2.2 CNV-seq结果分析CNV-seq检出非致病性变异者19例（10.05%），其中临床意义不明者13例（6.88%）、可能良性、良性者各3例。非单纯NT增厚组pCNVs、染色体非整倍体检出率均高于单纯NT增厚组，差异有统计学意义（P＜0.05），2组其他pCNVs检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。NT≥3.5 mm组pCNVs、染色体非整倍体检出率均高于2.5 mm≤NT＜3.5 mm组，差异有统计学意义（P＜0.05），2组其他pCNVs检出率差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。14例其他pCNVs包括10例（5.29%）微缺失/微重复综合征，4例（2.12%）非综合征致病性片段缺失/重复，见表2。

表1 不同NT增厚类型及程度分组pCNVs分析[例（%）]

表2 14例其他pCNVs及染色体核型分析

3 讨论

3.1 NT增厚核型分析研究表明，染色体异常发生率随NT厚度的增加而增加；当NT增厚合并其他超声异常时胎儿染色体异常的发生率明显增高[2]。NT增厚中染色体异常包括21、18和13三体综合征，以及Turner综合征、三倍体，微缺失/微重复综合征和某些单基因病（如Noonan综合征）[3]。在NT增厚的染色体异常胎儿中，50%为21三体综合征，25%为18或13三体综合征，10%为Turner综合征，5%为三倍体，10%为其他染色体异常[4]。有文献报道NT值位于2.4～3.4 mm、3.5～4.4 mm、4.5～5.4 mm、5.5～6.4 mm及≥6.5 mm时，胎儿染色体核型异常的发生率分别为10%、12%、33%、46%和58%[5]。研究表明NT≥2.5 mm染色体核型异常发生率为14.63%，其中染色体核型非整倍体发生率13.41%[6]，本研究与文献报道相似。非单纯NT增厚组及NT≥3.5 mm组染色体非整倍体风险（约2 1%）分别明显高于单纯N T增厚组和2.5 m m≤N T＜3.5 m m组。N T增厚合并其他指征或N T厚度≥3.5 m m时，对于焦虑的孕妇可选择绒毛穿刺术（孕1 1～1 3+6周），早期诊断可降低孕妇终止妊娠带来的伤害。由于绒毛穿刺对技术要求及风险高于羊膜腔穿刺术，本中心尚未开展绒毛穿刺术。本中心一般选择1 8周后进行羊膜腔穿刺术，但针对N T≥3.5 m m或N T增厚合并超声结构异常的孕妇知情选择可在孕1 6周后进行羊膜腔穿刺术。本研究染色体核型检出7例染色体结构异常的病例中3例染色体易位导致染色体重排时发生染色体片段缺失/重复，2例9号染色体臂间倒位，C N V-s e q可检出染色体缺失或重复，但无法检出染色体易位或倒位等。在我国欠发达地区的产前机构，针对N T增厚的胎儿染色体核型分析仍应作为产前诊断的首要检查方法。

3.2 致病性CNV分析随着产前诊断检测技术日益成熟，在NT增厚胎儿中pCNVs逐渐被发现。有研究发现NT≥3.0 mm胎儿pCNVs风险随NT厚度增加而增加[7]，pCNVs检出率21.8%～25.9%，其中染色体非整倍体、其他pCNVs检出率分别为16.93%～22.0%和3.9～4.91%[7-8]。文献报道对于NT≥3.5 mm染色体核型正常的胎儿，pCNVs检出率为5%～6.8%[9-10]。本研究发现当NT≥2.5 mm时，在染色体核型正常胎儿中额外检出5.63%的pCNVs，与选择NT≥3.0 mm胎儿或NT≥3.5 mm的胎儿研究相比基本相似。目前对NT界值作为介入性产前诊断的标准不一致，部分机构以NT≥3.0 mm为界值[7-8]，部分以NT≥2.5 mm为界值[2,4,6,10]。本研究9例染色体核型正常者中3例NT厚度在2.5～3.0 mm者检出pCNVs，且本研究发现其他pCNVs与NT增厚程度无明显相关性，这与其他研究一致[8,11]，因此笔者推荐当NT≥2.5 mm时，排除胎儿染色体非整倍体外，也应关注是否具有微缺失/微重复。此外，本研究其他pCNVs与NT增厚合并其他指征亦无相关性，但非单纯NT增厚组检出率（11.43%）高于单纯NT增厚组（5.04%），故认为胎儿NT增厚合并其他指征者是CNV-seq检查的重点对象，以避免漏诊其他的pCNVs，但此结论仍需大样本进一步研究。

3.3 微缺失/微重复综合征在NT增厚中最常见的pCNVs微缺失/微重复为22q11.2缺失、22q11.2重复、10q26.12q26.3缺失和12q21q22缺失[9]。22q11.2微缺失/微重复综合征表型均存在外显不全且高度可变，且存在相同或相似的临床表型[12-13]。22q11.2微缺失综合征主要与先天性心脏病、腭部异常等有关[13]，Tbox1转录因子（TBX1）基因缺失是心脏异常主要因素，本研究1例22q11.2微缺失综合征合并胎儿心脏异常的表型，因此，产前发现NT增厚合并心脏病的胎儿在排除非整倍体时，首先考虑是否合并22q11.2微缺失综合征。本研究发现3例合并1q21.1微缺失综合征，该综合征患者的表型存在外显不全且高度可变[14]，常见表型为面部畸形、小头畸形和发育迟缓等。16p13.11微缺失/重复区域为神经认知障碍易感区，存在外显不全，部分携带者无明显临床症状[15-16]。综上，NT增厚中微缺失/微重复综合征表型多数为外显不全或高度可变，即使胎儿与父母携带相同的致病性微缺失/微重复，也无法通过父母的表型准确判断胎儿出生后是否发病[1]。因此，在NT增厚检出外显不全的微缺失/微重复综合征的胎儿，在超声结构正常且染色体核型正常的情况下，主要的难点是产前咨询对其表型的预判，需充分告知孕妇及家属胎儿出生后的可能表型，使其知情并选择是否继续妊娠。

综上，随着NT增厚或合并其他介入产前诊断指征，胎儿染色体异常风险增加，主要为染色体非整体异常风险增加，但与其他pCNVs无明显相关，由于本研究样本量及其他pCNVs检出数量少，结果可能存在偏倚，仍需大样本进一步研究。染色体核型分析联合CNV-seq可避免染色体结构异常及染色体微缺失/微重复的漏诊，建议临床采用并积累经验提高诊断准确率。