胚胎植入前遗传学检测在性染色体异常夫妇助孕中的应用

沈鉴东，谢佳孜，吴畏，蔡令波，汪道武，刘嘉茵，刁飞扬

不孕不育门诊常见的染色体异常包括结构异常和数目异常，其中结构异常主要包括染色体相互易位、罗氏易位和倒位等，因其可导致染色体不平衡配子的产生，可导致不孕、反复自然流产和胎儿畸形等不良妊娠结局，临床上可以通过植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）来降低不良妊娠风险[1]。不孕不育人群中染色体数目异常主要涉及性染色体的非整倍体，常见的有45,X、47,XXX、47,XXY和47,XYY等，在新生儿中发生率约为1/420[2]。这类性染色体异常患者在减数分裂产生配子的过程中理论上会导致胚胎性染色体异常比例升高，但是实际发生率并不高，且与染色体非整倍体类型有关[1,3]。本研究回顾性分析既往南京医科大学第一附属医院生殖医学科（本中心）伴有性染色体异常的夫妇行PGT的治疗周期中胚胎染色体异常情况及性染色体异常占比，探讨此类人群中PGT的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象2015年1月—2021年12月本中心收治了夫妇双方之一携带有性染色体非整倍体且选择PGT助孕的23对夫妇，共24个促排卵周期，其中包括男性47,XYY及其嵌合体6例，男性47,XXY及其嵌合体2例，均伴有严重少、弱精子症；女性47,XXX 4例，女性45,X嵌合体8例（9个促排卵周期），女性X染色体节段性缺失3例（其中1例涉及X和Y染色体片段重组）。见表1。

1.2 卵巢刺激、胚胎培养及活检、胚胎移植采用临床常规促排卵方案，当超声监测成熟卵泡（直径≥16 mm）数量达到4枚及以上时，或者主导卵泡群已达到成熟大小（直径≥16 mm）时，皮下注射人绒毛膜促性腺激素6 500 U（艾泽，默克雪兰诺公司，德国），36～37 h后经阴道超声引导下穿刺取卵。卵子置于通用体外受精培养液（Origio公司，丹麦）中3 h，拆除颗粒细胞，选择MⅡ期卵子进行卵细胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），受 精 后 卵 子 置 于Quinn’s卵裂期培养液（Sage公司，美国）中，在湿化37℃三气培养箱（5%CO2，5%O2和90%N2）中孵育至第3天。利用激光破膜仪（MTG公司，德国）在受精后第3天（D3）胚胎透明带上打孔，直径约30μm，后改用Quinn’s囊胚培养液（Sage公司，美国）培养至D5或D6囊胚形成。D5或D6囊胚采用直径35μm活检针（Humagen公司，美国）活检滋养外胚层细胞（4～10个），胚胎活检后即采用玻璃化冷冻技术（玻璃化冷冻、解冻试剂盒，Kitazato Biophama公司，日本）进行胚胎冷冻保存，待胚胎检测结果择期复苏移植，每个移植周期移植1枚囊胚。

1.3 胚胎检测活检细胞采用核酸扩增试剂盒（SurePlex Kit，Illumina公司，美国）进行全基因组扩增，然后采用基于二代测序（next generation sequencing，NGS）技术的染色体拷贝数分析，采用VeriSeq-MiSeq Kit（Illumina公司，美国）制备文库，在MiSeq测序平台（MiSeqDx Universal Kit V3 SBS，美国）上进行全基因组低深度测序。下机数据采用云平台分析（PGXCloud，网址为www.pgxcloud.com），生物信息分析算法原理同先前的报道[4]。其中染色体异常比例＜20%报告为整倍体，异常比例在20%～80%报告为嵌合体，异常比例＞80%报告为非整倍体。

1.4 统计学方法统计2021年6月前复苏移植周期的临床结局，复苏周期移植结局包括未孕、自然流产和活产。临床妊娠指胚胎移植后B超见宫内妊娠囊。活产率=活产数/移植周期数×100%，自然流产率=自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%。嵌合体胚胎移植后均行羊水穿刺产前诊断，均未见异常。患儿出生后电话随访患儿一般健康情况。

2 结果

23对性染色体异常夫妇的24个促排卵周期，共获得可检测囊胚77枚，明确诊断76枚（98.70%），其中40枚（52.63%）为整倍体可移植胚胎，13枚（17.10%）为嵌合体胚胎，23枚（30.26%）为非整倍体不可移植胚胎。6个周期因为患者个人原因，没有返院移植。18个复苏移植周期获得9例（50.00%）健康活产，见表2。

表2 活检周期胚胎检测结果及复苏移植结局

2.1 47,XYY及其嵌合体在6例47,XYY及其嵌合体治疗周期中，男性患者均有严重少、弱精子症，共检测20枚囊胚，均明确诊断，其中13枚整倍体胚胎和1枚嵌合体胚胎，异常不可移植胚胎6枚，异常率为30.00%（6/20），且没有发现性染色体异常胚胎。有1例患者因为个人因素，没有返院移植。5个复苏移植周期中获得4例健康活产。

2.2 47,XXY及其嵌合体在2例47,XXY及其嵌合体中，共检测5枚囊胚，均明确诊断，其中3枚整倍体胚胎和1枚嵌合体非整倍体，异常不可移植移植胚胎为1枚，异常率为20.00%（1/5），无性染色体异常胚胎。2个复苏移植周期未获得活产。

2.3 47,XXX在4例47,XXX治疗周期中，共检测14枚囊胚，均明确诊断，其中9枚整倍体胚胎和3枚嵌合体非整倍体，异常不可移植胚胎为2枚，异常率为14.29%（2/14），其中性染色体非整倍体嵌合体2例。4个复苏移植周期中获得3例健康活产。

2.4 45,X嵌合体在8例45,X嵌合体患者的9个促排卵周期中共检测32枚囊胚，31枚明确诊断，其中13枚整倍体胚胎和7枚嵌合体非整倍体，异常不可移植胚胎为11枚，异常率为35.48%（11/31），其中1个异常胚胎合并有X染色体非整倍体嵌合体。6个复苏移植周期仅获得1例健康活产。

2.5 X染色体节段性缺失女性在3例女性X染色体节段性缺失治疗周期中，共检测6枚囊胚，均明确诊断，其中2枚整倍体胚胎和1枚嵌合体非整倍体，异常不可移植胚胎为3枚，异常率为50.00%（3/6），异常胚胎均表现为母源X染色体节段性缺失，见图1。1个复苏周期移植1枚非整倍体嵌合体胚胎，获得1例健康活产。

图1 X染色体节段性缺失女性PGT异常胚胎结果图

3 讨论

3.1 PGT的适应证及其临床价值从1990年首次报道以来，PGT已广泛应用于染色体异常、单基因病生育风险的预防[5]。2017年，欧洲人类生殖和胚胎学会等国际组织联合发布声明，建议将PGT的名称根据应用指征不同分为：染色体结构异常PGT（PGT for structure rearrangement，PGT-SR）、单基因病PGT（PGT for monogenic disease，PGT-M）和非整倍体筛查PGT（PGT for aneuploidy，PGT-A）[6]。其中PGT-A应用于胚胎植入前非整倍体筛查，以期提高临床体外受精-胚胎移植治疗的临床妊娠率，但是目前存在较大争议性[7-8]。近些年，高通量遗传检测技术，如染色体微阵列分析、二代测序等用于PGT，显著改善了PGT胚胎检测的准确性和效率，本文笔者所在团队也较早就在国内开展了基于高通量遗传检测技术的PGT，并取得了理想的妊娠结局[9-11]。对于性染色体异常夫妇的胚胎性染色体异常比例以及PGT的应用文献报道不多，2018年《胚胎植入前遗传学诊断/筛查专家共识》[1]对性染色体异常是否行PGT给予一定的建议，但是对于不同类型的性染色体异常夫妇胚胎的性染色体异常发生率，相关直接证据较少，不同类型性染色体异常后代出现性染色体异常的风险也存在差异，本研究回顾性分析本中心既往性染色体异常夫妇PGT的胚胎染色体检测结果以及妊娠结局，对性染色体异常夫妇性染色体异常配子或胚胎淘汰机制及临床遗传咨询具有一定参考意义。

3.2 47,XYY综合征患者的生育风险47,XYY综合征在男性新生儿中的发生率约为1∶1 000。一般来说，47,XYY综合征表型存在变异，可能具有的表现包括行为异常风险增加、轻微学习困难、语言发育迟缓和身材高大等[12]。采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）分析47,XYY综合征男性患者精子及卵裂胚发现，性染色体异常比例均较46,XY正常男性增加[13]，支持可对47,XYY综合征患者实施PGT。而本研究5例患者的20枚囊胚均未发现性染色体异常，这提示47,XYY综合征患者性染色体异常胚胎可能在囊胚形成前被淘汰。实际上47,XYY综合征患者后代染色体异常发生率不足1%[14-15]。因此，中华医学会男科学分会建议47,XYY综合征男性患者的生育治疗按常规处理[3]。

3.3 47,XXX综合征患者的生育风险47,XXX综合征即X三体综合征，在女性中的发病率约为1∶1 000，患者表型较轻微或者没有明显异常表型，所以估计实际诊断的患者仅占10%[16]。患者婴幼儿期语言发育可落后于同龄儿，轻微的学习困难，平均智商相对于普通人群低约20分，身体特征包括身材常较高，内眦赘皮，肌张力减退和第五指弯曲等。此外，卵巢早衰、精神行为异常也较普通人群更常见[17]。虽然也有研究报道47,XXX女性生育的后代出现性染色体异常，但是一般认为发生风险不足1%；但是，47,XXX嵌合体女性生育性染色体异常后代的风险比染色体正常女性增加[16]。本研究中4例47,XXX患者夫妇中有1例患者卵巢功能减退（AMH=0.36 ng/mL），其他3例患者卵巢功能正常，共检测14枚囊胚，其中2枚涉及X染色体和Y染色体的非整倍体嵌合体，这2枚胚胎均涉及多条染色体的非整倍体嵌合体，推测其可能是受精后胚胎细胞有丝分裂过程错误所致。

3.4 47,XXY综合征患者的生育风险47,XXY综合征即Klinefelter综合征，在男性新生儿中的发病率约为1∶600～1∶500[18]。典型的临床表型包括身材高、男性乳房女性化、睾丸小等，表型具有异质性，有些患者表型不典型[19]。95%～99%的患者由于生殖细胞的丢失和输精管的透明样变性而导致男性不育。ICSI技术诞生后，发现43%的47,XXY综合征患者可以通过传统睾丸穿刺（c-TESE）获得精子，而45%的患者可以通过显微睾丸精子提取（m-TESE）获得精子，通过TESE-ICSI可以获得约50%的活产率[20]。通过FISH技术对47,XXY综合征患者精液进行分析发现，正常精子比例从50%到93.7%不等[21]。有很多研究报道47,XXY男性通过ICSI助孕获得了染色体正常的后代[21]，但是也有研究报道47,XXY男性的后代仍为47,XXY[22]。在利用FISH技术的PGT中，发现47,XXY综合征患者胚胎整倍体率（54.0%）显著低于核型正常男性（77.2%）；分析性染色体发现，47,XXY综合征胚胎性染色体异常率占13.2%，而核型正常男性为3.1%；并且常染色体非整倍体中具有显著差异的是18号和21号染色体，这些都提示在47,XXY综合征咨询中需慎重讨论生育风险，酌情选择PGT或者产前诊断[21]。本研究中1例47,XXY和1例47,XXY/46,XY嵌合体，共活检5枚囊胚，检测结果提示未涉及性染色体异常。

3.5 45,X综合征患者的生育风险45,X综合征即特纳综合征（Turner syndrome），是女性最常见的性染色体异常，在新生儿中发病率约1∶1 700[23]，常由X染色体整条或者部分缺失导致，嵌合体核型也比较常见，与其表型轻重变异有关。患者常表现为早发性卵巢功能不全，身材矮小，也有一些患者会有复杂心血管异常表型[24]、代谢[25-26]和免疫异常[27]。文献报道45,X综合征的自然妊娠率可达5.6%[28]，甚至高达14%[29]。但是，45,X综合征的妊娠并发症显著增加，如妊娠早期妊娠丢失、妊娠期高血压疾病、主动脉夹层、早产，以及胎儿染色体异常和先天畸形等[29]。Dogˇer等[30]研究显示，在22例45,X嵌合体的52次妊娠中，活产率仅占32.7%，流产率高达67.3%。45,X综合征患者妊娠丢失率高的原因可能有：胎儿染色体异常风险增加[28]，雌激素过低导致子宫内膜容受性降低[31]，伴发甲状腺自身免疫性疾病的风险高[32]。对于45,X综合征患者生育的后代中性染色体异常比例，由于相当部分患者后代并没有做羊水穿刺或者产后的染色体诊断，文献中并没有报道明确发生率。有研究报道X环状染色体嵌合体母亲生育X环状染色体嵌合体后代[29]。本研究中8例45,X嵌合体的9个治疗周期，共检测32枚囊胚，仅1例患者（病例10）的1个胚胎出现X染色体片段缺失嵌合体改变，可能来自于受精卵形成后的有丝分裂过程。所有PGT治疗周期结局并不理想，与先前文献报道的45,X及其嵌合体临床妊娠丢失率高的现象相符。所以，对此类患者进行辅助生殖技术治疗前，应该充分告知其不良的妊娠结局风险。

3.6 X染色体节段性缺失女性值得注意的是，在45,X嵌合体患者中并未观察到性染色体减数分裂错误导致的胚胎性染色体异常风险显著增加，但是在3例X染色体节段性缺失的病例[der（X）t（X;Y）（p22.3;q11.2）、del（X）（p21）和del（X）（q22.3q27.1）]中，共检测了6个囊胚，有3个胚胎均出现相应的X染色体节段性缺失，异常率达50.00%。共1次复苏周期移植1枚非整倍体嵌合体胚胎，获得健康活产。这提示对于X染色体节段性缺失这一特殊类型的45,X综合征，由于着丝粒和纺锤体功能完整，异常染色体可能遵循孟德尔遗传，生育遗传风险较大，这组病例的胚胎中并没有观察到X染色体节段性缺失的男性胚胎，可能与此类男性胚胎早期致死有关，无法发育到囊胚阶段。由于患者卵巢功能减退，可检测胚胎数目较少，PGT无可移植胚胎风险高，患者夫妇助孕前需充分咨询相关风险。

综上所述，性染色体异常是生殖医学门诊常见的染色体异常类型，其生殖预后差异较大。47,XYY、47,XXX、47,XXY患者胚胎性染色体异常风险不高；45,X及其嵌合体的临床妊娠结局较差，胚胎种植率低、流产率高；对于X染色体节段性缺失45,X综合征患者胚胎性染色体异常风险较高，辅助生殖技术前均需要审慎咨询相关风险。