乙型肝炎肝硬化失代偿期并发自发性细菌性腹膜炎患者临床分离菌的分布特点及耐药情况分析*

张 旺,王国充,张 甜,李伯安△

1.中国人民解放军总医院第五医学中心检验科，北京100039；2.河北北方学院医学检验学院，河北张家口 075132

世界卫生组织数据显示，截至2015年，全球约有2.57亿人感染乙型肝炎病毒(HBV)[1]，目前我国慢性乙型肝炎(CHB)患者有20 000 000～30 000 000例[2]。自发性细菌性腹膜炎(SBP)为乙型肝炎肝硬化失代偿期常见的严重并发症[3-4]，能导致患者发生脓毒症休克、肝性脑病、肝肾综合征等。若患者未得到有效治疗，病死率达20%～30%[5]，广谱抗菌药物对乙型肝炎肝硬化失代偿期腹腔感染有一定的效果，但由于近年来抗菌药物的滥用，细菌耐药性明显增强，抗菌效果不理想。因此，了解乙型肝炎肝硬化失代偿期腹腔感染患者病原菌的分布情况并及时使用针对性抗菌药物十分关键。本研究分析了乙型肝炎肝硬化失代偿期腹腔感染患者腹水培养临床分离菌的流行病学特点，并进行药敏分析，进一步阐述细菌的耐药性特点，为临床合理使用抗菌药物提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1月至2021年12月中国人民解放军总医院第五医学中心收治的腹腔积液培养阳性乙型肝炎肝硬化失代偿期并发SBP患者187例为研究对象，其中男150例，女37例；年龄 31～87岁，平均(56.35±11.39)岁。纳入标准：(1)乙型肝炎肝硬化失代偿期患者诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[6]中的相关诊断标准；(2)SBP患者诊断均符合《肝硬化腹水及相关并发症的诊疗指南》[7]中的相关诊断标准。排除肿瘤性腹腔积液或者继发性腹膜炎患者。

1.2仪器与试剂 法国梅里埃BacT/ALERT 3D120全自动血培养仪，德国布鲁克MALDI-TOF-MS基质辅助激光解析飞行时间质谱仪，法国梅里埃 VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定和药敏分析系统，英国Oxoid Limited药敏试验纸片，赛默飞世尔生物公司生产的玫红酸中国蓝乳糖琼脂平板、哥伦比亚血平板、念珠菌显色平板、Mueller-Hinton(MH)平板等。

1.3方法 对入组研究对象行腹腔穿刺，分别抽取10 mL腹腔积液置于需氧和厌氧血培养瓶中，所有入组患者均采集双瓶送检，患者采集腹腔积液前均未使用任何抗菌药物。所有操作严格按照《全国临床检验操作规程》进行。本研究采取回顾性分析方法，不存在为试验目的对入组患者行任何侵入性操作，已通过伦理审批，获得受试者知情同意。

1.4细菌培养及药敏试验 腹腔积液采用梅里埃BacT/ALERT 3D120全自动血培养仪进行增菌培养，阳性培养液选用玫红酸中国蓝乳糖琼脂平板、哥伦比亚血平板或念珠菌显色平板转种获取纯菌落，使用布鲁克MALDI-TOF-MS基质辅助激光解析飞行时间质谱仪进行菌种分析鉴定[8]。使用梅里埃 VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定和药敏分析系统对培养所得的阳性菌株进行药敏试验，结合纸片扩散法和E-test最小抑菌浓度(MIC)法进行补充药敏试验，药敏培养基选择MH平板，配套使用相关药敏试验纸片，药敏执行标准参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100 ED30[9]。质控菌株：阴沟肠杆菌ATCC700323、肺炎克雷伯菌ATCC700603、大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212。

1.5观察指标 (1)分析腹腔积液培养阳性乙型肝炎肝硬化失代偿期并发SBP患者临床分离菌分布情况；(2)分析主要临床分离菌对抗菌药物的耐药性。

2 结 果

2.1菌株分布特点 187例腹腔积液培养阳性乙型肝炎肝硬化失代偿期并发SBP患者送检的腹腔积液标本共检测出220株临床分离菌，其中分离出单一菌患者159例，分离出两种菌患者23例，分离出3种菌患者5例。革兰阳性需氧及兼性厌氧球菌120株(占54.54%)，革兰阳性需氧及兼性厌氧杆菌21株(占9.54%)，革兰阴性需氧及兼性厌氧杆菌72株(占32.73%)，厌氧菌1株(占0.46%)，真菌6株(占2.73%)。主要临床分离菌包括凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)73株，肠杆菌科细菌58株，分别占33.18%和26.36%。220株临床分离菌菌种分布及在阳性瓶中的检出情况见表1。

表1 220株临床分离菌菌种分布及在阳性瓶中的检出情况

2.2主要临床分离菌对抗菌药物的耐药性

2.2.1革兰阳性需氧及兼性厌氧球菌

2.2.1.1葡萄球菌属细菌 187例腹腔积液培养阳性乙型肝炎肝硬化失代偿期并发SBP患者检测出葡萄球菌属细菌共78株，包括5株凝固酶阳性葡萄球菌(均为金黄色葡萄球菌)和73株CoNS，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)2株，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCoNS)58株。葡萄球菌属对青霉素的耐药率超过90.00%，CoNS对红霉素的耐药率为65.75%，对左氧氟沙星、克林霉素、复方磺胺甲噁唑和环丙沙星的耐药率均大于30.00%。未检测出对喹奴普汀/达福普汀、替加环素、利奈唑胺和万古霉素耐药菌株。主要葡萄球菌属细菌对临床常用抗菌药物的耐药性分布见表2。

表2 主要葡萄球菌属细菌对临床常用抗菌药物的耐药性分布

2.2.1.2肠球菌属细菌 187例腹腔积液培养阳性乙型肝炎肝硬化失代偿期并发SBP患者检测出肠球菌属细菌共16株，包括15株屎肠球菌和1株粪肠球菌。15株屎肠球菌对青霉素、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星和红霉素有很高的耐药率，耐药率达80.00%及以上，对高水平庆大霉素协同、高水平链霉素协同、四环素有较高的耐药率，耐药率均在50.00%左右。仅检出1株对万古霉素耐药屎肠球菌和1株对喹奴普汀/达福普汀耐药屎肠球菌，未检出对替加环素和利奈唑胺耐药菌株。主要肠球菌属细菌对临床常用抗菌药物的耐药性分布见表3。

表3 主要肠球菌属细菌对临床常用抗菌药物的耐药性分布

2.2.2革兰阴性需氧及兼性厌氧杆菌

2.2.2.1肠杆菌科细菌 187例腹腔积液培养阳性乙型肝炎肝硬化失代偿期并发SBP患者检测出肠杆菌科细菌共58株，包括31株大肠埃希菌，13株肺炎克雷伯菌，8株阴沟肠杆菌和6株其他肠杆菌科细菌，其中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肠杆菌共20株，占分离肠杆菌的34.48%。31株大肠埃希菌对氨苄西林的耐药率很高，达74.19%，对其他青霉素类，第一、二、三代头孢菌素，喹诺酮类，磺胺类和氨曲南药物有较高的耐药率，耐药率均超过30.00%，而对哌拉西林/他唑巴坦复合制剂，第四代及半合成广谱第二、三代头孢菌素(如头孢替坦和头孢他啶)，碳青霉烯类，氨基糖苷类药物的耐药率较低，耐药率均低于20.00%。13株肺炎克雷伯菌对哌拉西林表现出较高的耐药率，达61.54%，对其他常用抗菌药物的耐药率都较低。8株阴沟肠杆菌对第一、二代头孢菌素有很高的耐药率，达75.00%及以上，对哌拉西林，第三、四代头孢菌素和氨曲南有较高的耐药率，均超过30.00%。主要肠杆菌科细菌对临床常用抗菌药物的耐药性分布见表4。

表4 主要肠杆菌科细菌对临床常用抗菌药物的耐药性分布

2.2.2.2非发酵菌 187例腹腔积液培养阳性乙型肝炎肝硬化失代偿期并发SBP患者检测出非发酵菌共11株，包括4株鲍曼不动杆菌和7株其他非发酵菌。4株鲍曼不动杆菌均表现出多重耐药性，除2株对复方磺胺甲噁唑敏感，1株对妥布霉素敏感外，其余对临床常用抗菌药物均耐药。主要非发酵菌(鲍曼不动杆菌)对临床常用抗菌药物的耐药性见表5。

表5 主要非发酵菌(鲍曼不动杆菌)对临床常用抗菌药物的耐药性

3 讨 论

乙型肝炎病毒相关慢性肝病患者普遍存在能量代谢异常，SBP发生风险较高[10]，SBP是乙型肝炎肝硬化失代偿期患者死亡的重要原因[11-12]。腹腔积液培养为SBP患者的明确诊断和合理治疗提供了金标准，而准确甄别腹腔积液培养阳性结果中的临床致病菌和可疑污染菌也是临床工作的关键和难点。腹腔穿刺过程中由皮肤定植菌引起的污染是造成腹腔积液培养假阳性的主要因素之一[13]。本研究中，共分离出11株棒杆菌属细菌和5株芽孢杆菌属细菌，阳性报警时间均>48 h，68.75%(11/16)为单瓶报阳，初步推断，以芽孢杆菌属和棒杆菌属为主的革兰阳性需氧及兼性厌氧杆菌，很可能是造成乙型肝炎肝硬化失代偿期患者腹腔积液培养假阳性的主要菌群；CoNS方面，54.79%(40/73)为双瓶报阳，76.71%(56/73)阳性报警时间<48 h，当培养出该类细菌时，应结合患者降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、腹水多核细胞数量、腹水蛋白等检验指标进行综合分析，或许能一定程度避免污染菌对临床诊断的干扰；肠杆菌科方面，75.86%(44/58)为双瓶报阳，98.28%(57/58)阳性报警时间<48 h，或可推断分离到以肠杆菌科为主的革兰阴性需氧及兼性厌氧杆菌对SBP患者的病原学确诊意义更大。本研究入组的187例研究对象中，分离出单一菌的病例占85.03%(159/187)，说明乙型肝炎肝硬化失代偿期合并SBP主要由单一致病菌感染引起，CoNS(占33.18%)和肠杆菌科细菌(占26.36%)是主要致病菌。

临床可根据细菌培养及其药敏试验结果合理选用抗菌药物治疗，以提高其临床疗效。本研究结果显示，主要革兰阳性菌为CoNS，其中又以表皮葡萄球菌占比最大，90.00%以上的葡萄球菌属和肠球菌属细菌对青霉素耐药；CoNS对甲氧西林和红霉素耐药率很高，分别为79.45%和65.75%；主要革兰阳性菌对万古霉素、喹奴普汀/达福普汀、替加环素和利奈唑胺的敏感性都很高。由此可知，对于革兰阳性菌引起的感染，可采用万古霉素、喹奴普汀/达福普汀、替加环素和利奈唑胺等治疗，应避免使用β-内酰胺类(除外抗MRSA的头孢菌素)、红霉素类等抗菌药物。主要革兰阴性菌为肠杆菌科细菌，其中又以大肠埃希菌占比最大，有34.48%的肠杆菌科细菌为产ESBLs菌株；大肠埃希菌对氨苄西林的耐药率很高，达74.19%；主要肠杆菌科细菌对哌拉西林/他唑巴坦复合制剂、碳青霉烯类、氨基糖苷类药物的敏感性均较高。由此可知，对于由肠杆菌科细菌引起的感染，可采用哌拉西林/他唑巴坦复合制剂、碳青霉烯类、氨基糖苷类抗菌药物治疗，应避免使用青霉素类抗菌药物。

欧洲肝病学会和美国肝病学会指南[5,14]推荐一线抗菌药物治疗首选第三代头孢菌素，替代方案包括阿莫西林/克拉维酸和环丙沙星或左氧氟沙星等喹诺酮类药物。而在本研究中，大肠埃希菌对第三代头孢菌素头孢曲松的耐药率达到了48.39%，CoNS、屎肠球菌和大肠埃希菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均超过了30.00%，这无疑挑战了喹诺酮类药物在SBP抗感染经验性治疗中的突出作用。大量使用喹诺酮类药物进行预防、侵入性操作及广谱抗菌药物的使用及重症监护病房住院标准的拓宽等因素，是引起SBP细菌学变化的重要原因[15]。有研究指出，针对院内发生SBP的患者，给予碳青霉烯类抗菌药物或替加环素是最有效的选择，这与本研究结果较为一致[16]。一项来自于欧洲的研究表明，在肝硬化失代偿期，由多重耐药(MDR)细菌引起的感染发病率逐渐升高[17]。在本研究中，分离出了包括葡萄球菌属、肠球菌属、肠杆菌科及非发酵菌等在内的多株MDR细菌，临床医生应该引起高度重视。

乙型肝炎肝硬化失代偿期患者存在严重的免疫功能障碍，表现为明显的免疫抑制和持续的促炎状态，因此，该类患者的真菌感染风险增加[18-20]。本研究中也分离到了6株真菌，并且均为双瓶检出，真菌在该类患者中的感染风险应该引起临床的高度重视。当常规使用抗菌药物治疗SBP患者而临床症状没有明显改善时，应在抗菌药物方案中加入抗真菌药物进行治疗。因此，充分认识临床分离株的流行病学特点和其耐药性分布，是指导乙型肝炎肝硬化失代偿期并发SBP患者经验性抗菌药物治疗的关键，建议及早进行经验性广谱抗菌药物治疗，直至培养结果能够指导抗菌药物的靶向使用。