菊苣酸对仔猪人工感染猪德尔塔冠状病毒的保护效果研究

谢永生，牛佳伟，李松倍，陈一波，李玉静，易宏波，贺东生,3*

（1.华南农业大学兽医学院广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东 广州 510642；2.广东省农业科学院动物科学研究所畜禽育种国家重点实验室，广东 广州 510640；3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心，广东 肇庆 526238；4.云南省保山市施甸县畜牧兽医中心，云南 保山 678200）

猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是近年来一种新发现的猪肠道冠状病毒，是冠状病毒科、δ 冠状病毒属的成员[1-4]。PDCoV 感染后，可引起仔猪腹泻、呕吐、脱水和消瘦等症状，其死亡率与猪流行性腹泻病毒（PEDV）接近，可导致40%～60%新生仔猪死亡[5-7]。其引起的肠道和组织学病变与PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）相似，肠道是其主要的靶器官，可导致小肠绒毛大量萎缩，造成吸收不良[8-9]。近年来因PDCoV 感染而引起的腹泻疫情，给各国养猪业造成了严重的经济损失[10-11]。

近期发现PDCoV 具有广泛的宿主谱和潜在的公共卫生危害，已有研究表明PDCoV 已具有跨越种间屏障，可感染鸡[12]、犊牛[13-14]以及人[15]等。这表明PDCoV 仍在持续的变异和进化，且有可能成为一种新的人畜共患病毒。

PDCoV 引起的新发冠状病毒病，缺乏有效的疫苗和药物可用。紫锥菊是一种多年生的菊科草本植物，其系列产品已被列为国家一类、二类新兽药。菊苣酸是紫锥菊的主要活性成分，前期研究结果表明菊苣酸具有抗炎、抗病毒、调节免疫功能等作用，与紫锥菊的功效接近[16-18]。但在世界范围内未见菊苣酸保护猪群抗PDCoV 感染的研究报道，因此本研究将菊苣酸以口服方式饲喂8 日龄的哺乳仔猪后，再经PDCoV 攻毒，以评估菊苣酸对攻毒仔猪的保护效果，为PDCoV 的感染与防控提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料PDCoV NC 株由本实验室分离；36 头8 日龄的哺乳仔猪购自广州周边某商品化养猪场，利用本研究团队已建立的猪腹泻病毒检测方法进行检测[19]，所有实验猪的PEDV、TGEV、PDCoV、猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）和猪轮状病毒（PoRV）抗原均为阴性。

Premix ExTaqTM（Probe qPCR）、RNase-free H2O 等购自宝生物工程（大连）有限公司；0.25%胰酶、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM 培养基均购自Gibco 公司；AxyPrep 病毒DNA/RNA 提取试剂盒购自康宁生命科学有限公司；菊苣酸购自成都普菲德生物技术有限公司。

1.2 实验设计将36 头健康的8 日龄哺乳仔猪，按体重与性别随机分成4 组，每组9 头。4 组分别为：空白组、攻毒组、菊苣酸组+攻毒组、菊苣酸组。各组仔猪均自由采食与饮水。

从实验第1 d 开始，菊苣酸+攻毒组和菊苣酸组仔猪每天口服3.6 mg/kg 体重的菊苣酸（溶解于10 mL PBS），空白组和攻毒组仔猪每天口服10 mL PBS，连续口服至实验结束。在实验第3 d（仔猪为10 日龄时），将攻毒组和菊苣酸+攻毒组的每头仔猪口服10 mL PDCoV NC 分离株（105TCID50/mL）进行攻毒，而空白组和菊苣酸组的每头仔猪口服10 mL DMEM。

1.3 引物设计在PDCoV M 基因（JQ065042）的保守区域设计1 条探针（FAM-CACACCAGTCGTTAAGCAT GGCAAGCT-BHQ）和1 对特异性荧光定量PCR 引物（F：5'-ATCGACCACATGGCTCCAA-3'/R：5'-CAGCT CTTGCCCATGTAGCTT-3'），用于PDCoVTaqMan 荧光定量PCR 检测。

1.4 各组仔猪的平均日增重和腹泻情况统计实验期间对各组仔猪称重并计算平均日增重。实验开始后每天记录仔猪的精神状态和腹泻情况，并对仔猪的腹泻程度评分：0 分代表粪便正常（没有腹泻）；1 分代表粪便软化；2 分代表粪便中含有一定的液体，为中度腹泻；3 分代表水样腹泻。2 分或2 分以上评分为腹泻。

1.5 剖检及组织病理学变化实验第7 d 对仔猪剖杀，检查并记录各组仔猪的肠段是否有肉眼可见的病变（包括肠壁变薄、透明或充气等）。采集每头仔猪的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠肠段各2 份，1 份置于4%的多聚甲醛溶液中固定制作病理切片，HE 染色后观察肠道组织病变；另1 份保存于-80 ℃用于后续病毒含量的定量检测。

1.6 各组仔猪肠道病毒载量的检测将1.5 中采集的各组仔猪的肠道组织样品分别剪取1 g 装入2 mL RNase-free 的离心管中，并加入1 mL PBS 和4 颗小钢珠，利用组织研磨仪充分研磨后，8 000 r/min 15 min。取150 μL上清液，利用AxyPrep病毒DNA/RNA试剂盒提取病毒RNA，反转录为cDNA，以其为模板，利用绝对荧光定量PCR方法，检测肠道组织中的PDCoV载量。反应体系为25 μL：2×Premix ExTaq（Probe qPCR）12.5 μL，探针、上游引物F 和下游引物R 各0.5 μL，模板2 μL，RNase-free H2O 9 μL。反应程序为：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 个循环。

1.7 各组仔猪肠道抗病毒基因转录水平的检测参考文献[20]中的引物、反应体系和程序，利用相对荧光定量PCR 方法检测肠组织中抗病毒基因OAS、Mx1和PKR mRNA的转录水平。利用2-ΔΔCt算法，以β-actin作为内参基因计算每个目的基因mRNA 的相对转录水平。利用SPSS 软件进行单因素方差分析，以图基检验法进行多重比较，P＞0.05 表示差异显著；P＜0.01 表示差异极显著。利用GraphPad Prism 软件绘制柱状图。

2 结 果

2.1 各组仔猪腹泻的评分统计在实验过程中空白组和菊苣酸组仔猪均采食正常，精神状态良好，无临床症状出现。攻毒组仔猪在实验第4 d（攻毒后1 d），有6 头仔猪出现粪便软化；此后腹泻逐渐严重，至实验第7 d（攻毒后4 d），仔猪腹泻达到高峰，所有仔猪均出现水样腹泻。菊苣酸+攻毒组仔猪在实验第4 d（攻毒后1 d），有4 头仔猪出现粪便软化；至实验第7 d（攻毒后4 d），有3 头仔猪出现了水样腹泻，5 头仔猪为中度腹泻，1 头仔猪为粪便软化。为直观的呈现各组仔猪的腹泻情况，统计4 个实验组仔猪每天的腹泻评分，结果显示攻毒组仔猪的腹泻程度比菊苣酸+攻毒组更严重，而空白对照组和菊苣酸组仔猪均无腹泻症状（图1），表明仔猪口服菊苣酸后可减轻因PDCoV 攻毒引起的腹泻症状。

图1 各组仔猪的临床腹泻评分Fig.1 The clinical diarrhea score of piglets in each group

2.2 各组仔猪的平均日增重实验期间对各组仔猪称重，统计4 个实验组仔猪的平均日增重，结果显示，攻毒组仔猪的平均日增重最小，而菊苣酸+攻毒组仔猪的平均日增重与空白组和菊苣酸组接近。经差异分析显示，攻毒组仔猪的平均日增重显著低于菊苣酸+攻毒组、空白组和菊苣酸组（P＜0.05），而菊苣酸+攻毒组与空白组、菊苣酸组仔猪的平均日增重无显著性差异（图2）。表明仔猪口服菊苣酸后，可显著改善因PDCoV 攻毒而造成的体重减少。

图2 各组仔猪的平均日增重Fig.2 Average daily gain of piglets in each group

2.3 各组仔猪的剖检病变及肠组织病理学观察实验第7 d，在攻毒组仔猪的腹泻达到最高峰时，对所有仔猪剖杀，并检查各组实验猪肠道病变。眼观肠道病变可见，空白组和菊苣酸组仔猪的各肠段均正常，无明显剖检病变；攻毒组仔猪的十二指肠、空肠和回肠病变明显，尤其是空肠，肠壁变薄、呈现透明状，部分可见有少量气体；菊苣酸+攻毒组仔猪的小肠也出现了病变，但与攻毒组相比，其病变更轻微，空肠无明显变薄或透明状。表明PDCoV 攻毒后引起的病变主要在小肠，导致小肠壁变薄，且菊苣酸可以减轻PDCoV 所致的仔猪小肠病变程度。

选择十二指肠、空肠和回肠组织进行病理学观察，结果显示，空白组和菊苣酸组仔猪的十二指肠、空肠和回肠绒毛无明显脱落和病变；而攻毒组仔猪的十二指肠、空肠、回肠绒毛损伤最严重，大量的肠绒毛脱落后，导致肠绒毛变短；菊苣酸+攻毒组仔猪的十二指肠、空肠、回肠也有少量的肠绒毛脱落，但与攻毒组相比，该组仔猪的肠绒毛更完整且数量更多，无大面积的脱落（图3）。表明仔猪口服菊苣酸后可以减轻因PDCoV 攻毒造成仔猪小肠组织的病理损伤。

图3 各组仔猪的小肠组织病理变化Fig.3 Pathological changes for small intestine tissues of piglets in each group

2.4 各组仔猪的小肠病毒载量检测结果利用PDCoVTaqMan 荧光定量PCR 方法检测十二指肠、空肠和回肠组织中的病毒含量，结果显示，空白组和菊苣酸组仔猪的小肠组织中均未检测到PDCoV 核酸，但攻毒组和菊苣酸+攻毒组仔猪的十二指肠、空肠和回肠中均可以检测到病毒核酸，表明攻毒后PDCoV在仔猪的肠道内增殖。对攻毒组和菊苣酸+攻毒组仔猪的肠道病毒载量进行比较，结果显示攻毒组仔猪的十二指肠、空肠和回肠中的病毒载量均比菊苣酸+攻毒组高，且攻毒组仔猪的空肠和回肠的病毒载量显著高于菊苣酸+攻毒组（P＜0.05）（图4）。此外，在小肠的3 个肠段中，回肠中的病毒载量最高，其次是空肠，而十二指肠中的病毒载量相对最低，表明空肠和回肠是PDCoV 的主要感染肠段。但在菊苣酸+攻毒组仔猪的肠道组织中仍可检测到病毒，上述结果表明仔猪口服菊苣酸后但可以降低小肠组织中的PDCoV 载量，但菊苣酸不能完全阻止PDCoV 的感染及其在机体内的复制。

图4 各组仔猪的小肠病毒载量检测结果Fig.4 Intestinal viral load test results of piglets in each group

2.5 各组仔猪的抗病毒基因转录水平的检测结果剖检结果和小肠病毒载量检测结果显示，PDCoV 攻毒后引起的病变主要在小肠，其中空肠和回肠是PDCoV 的主要感染肠段。因此选择各组仔猪的空肠和回肠肠段，采用相对荧光定量PCR检测抗病毒基因的转录水平，结果显示，与空白组、菊苣酸组相比，攻毒组和菊苣酸+攻毒组仔猪空肠和回肠中抗病毒基因OAS和Mx1的转录水平显著升高，而抗病毒基因PKR 在空肠中的转录水平显著升高。在回肠中的转录水平各组间无显著差异（图5）。结果表明仔猪口服菊苣酸后再进行PDCoV 攻毒后，其空肠和回肠中抗病毒基因的转录水平增加，而抗病毒基因的转录有利于抑制病毒在机体中的复制，以减少PDCoV 对肠道的损伤。

图5 各组仔猪的空肠和回肠中抗病毒基因mRNA转录水平的变化Fig.5 Changes for mRNA transcription level of antiviral genes in jejunum and ileum of piglets in each group

3 讨 论

冠状病毒由于其基因组庞大，在病毒复制过程中基因组容易发生变异，进而产生新的变异株；此外不同种类的冠状病毒在不同的中间宿主体内又可进一步发生基因重组和缺失，使得变异重组后的冠状病毒拥有跨物种传播的能力。因此，基因的突变与重组、基因交换、基因插入或缺失等引起的病毒基因组的改变使冠状病毒感染的防制更加困难[21]。

本研究团队前期研究中，利用ST细胞从发生腹泻的PDCoV 阳性仔猪小肠内容物样品中分离和鉴定了PDCoV，但缺乏PDCoV对仔猪的致病性研究数据[22-23]。本研究的攻毒组仔猪在口服10 mL（105TCID50/mL）PDCoV 细胞培养病毒液后，可出现典型的水样腹泻、呕吐和精神沉郁等临床症状，在攻毒后第4 d 腹泻达到高峰；剖检结果显示，攻毒组仔猪的空肠和回肠病变最典型，肠壁变薄，呈现透明状；病理切片结果显示攻毒组的仔猪小肠绒毛大量脱落；利用荧光定量PCR 方法在仔猪小肠组织中可检测到病毒RNA，并且空肠和回肠中的病毒载量最高，表明病毒在机体内进行了复制，这与刘秋歌等已发表的PDCoV 攻毒实验结果一致[24]。

PDCoV 作为一种新出现的致病性猪肠道冠状病毒，当前仍然无商品化的疫苗可用于该疾病的防控，因此开发有效治疗PDCoV 感染的药物显得尤为重要。Zhang 等发现罗丹宁衍生物LJ001 可通过影响病毒RNA 和蛋白质的合成，进而抑制TGEV 和PDCoV 在ST 细胞中的复制[25]。Brown 等在细胞水平上进一步发现瑞德西韦对PDCoV 具有明显的抑制效果[26]。Zhai 等发现氯化锂和甘草酸二铵均可抑制PDCoV 在猪肾细胞（LLC-PK）细胞中的复制，但氯化锂影响病毒感染的早期阶段，而甘草酸二铵影响病毒吸附阶段[27]。本研究中将哺乳仔猪每天口服菊苣酸后，再进行PDCoV 攻毒，结果发现菊苣酸+攻毒组仔猪的腹泻症状、平均日增重、肠组织病变程度、肠道绒毛形态等方面都优于或轻于攻毒组，表明菊苣酸能够对仔猪提供抗PDCoV 攻击的能力；而菊苣酸作为新兽药紫锥菊的主要有效成分，可添加于饲料中，与其他药物相比，其更易大规模应用于临床养殖业中。

Zhang 等研究发现菊苣酸在10 μg/mL～100 μg/mL时可显著减轻D-半乳糖胺诱导的人HL-7702 肝细胞的损伤，在1 μg/mL～100 μg/mL 时可显著抑制受感染的鸭肝细胞中鸭乙型肝炎病毒DNA 的复制，而10 μg/mL～100 μg/mL 的菊苣酸可显著降低人肝癌细胞中乙型肝炎病毒的含量[28]。而在本研究中，8 日龄哺乳仔猪每天口服3.6 mg/kg 体重的菊苣酸后，就可抵抗PDCoV 的攻毒，且绝对荧光定量PCR 检测发现，菊苣酸+攻毒组仔猪的十二指肠、空肠和回肠中的PDCoV 载量比攻毒组更低，表明口服菊苣酸后可能抑制了PDCoV 在仔猪肠道中的复制。

先天免疫是宿主抵御病毒感染的第一道防线，在病毒感染宿主后，机体会快速识别病毒，并随即引起天然免疫应答反应，通过调控抗病毒基因的表达，进而限制病毒在机体内的复制。为揭示菊苣酸抗PDCoV 的可能机制，本研究进一步检测了空肠和回肠中抗病毒基因的转录水平。结果显示，与空白组、菊苣酸组和攻毒组相比，抗病毒基因OAS、Mx1和PKR 在菊苣酸+攻毒组中的转录水平最高；且抗病毒基因的转录水平与小肠病毒载量呈负相关，推测菊苣酸有可能通过刺激机体抗病毒基因的大量表达，从而抑制病毒在机体内的复制，以减少PDCoV对肠道造成损伤。

总之，本研究利用哺乳仔猪首次评估了菊苣酸对PDCoV 攻毒的保护效果，发现菊苣酸对仔猪抗PDCoV 感染具有预防效果，初步揭示了菊苣酸抗病毒作用的分子机理，为后期抗PDCoV 感染的研究和防控等提供了参考依据。