青稞HvBAS1基因的克隆及表达分析

司建萍，段瑞君，周嘉诚，马生莲，王改妮

(青海大学 生态环境工程学院，西宁 810016)

油菜素类固醇(brassinosteroids, BRs)是一种广泛存在的天然植物激素，对植物的生长发育必不可少，且密切参与植物的抗逆调节过程(旱、寒、虫、病、重金属污染等)。在农作物中，BRs参与控制多个重要的农艺性状，如开花时间、植株形态结构、种子产量以及胁迫耐受等，通过改变内源BRs水平或信号通路，抑或外源施加激素或激素抑制剂等方式，都有望增强植物的抗逆性，改善农艺性状，提高作物产量。在水稻中，内源油菜素内酯的水平变化不仅改变叶片直立角度，还直接影响花粉和种子的发育[1-2]。此外，外源施加人工合成的BRs能够提高亚麻与番茄幼苗的抗旱性[3-4]，增强玉米和西瓜的耐盐性[5-6]，降低冷害对桃果实的伤害[7]。

目前发现的BRs已超过70种，但其中仅有终产物油菜素内酯(brassinolide，BL)和油菜素甾酮(castasterone，CS)具有生物活性[8]。活性BRs的水平受到其合成与分解的双重调节。在拟南芥中，目前发现6个BRs失活相关基因：SOB7、BAS1、AtUGT73C5、AtUGT73C6、AtST4a和AtST1，通过羟基化、糖基化或磺基化方式使BRs失活，其中BAS1编码蛋白作为C-26羟化酶催化BL和CS的失活[9-10]。

自1999年在拟南芥中发现BAS1基因以来[9]，科研工作者陆续在不同植物中发现其同源基因：如胡萝卜中的DcBAS1，DcBAS1能够催化CS和BL的C-26发生羟化反应，该基因在拟南芥中异源过表达后植株表现出为矮化、叶片卷曲、叶柄缩短等典型的BR缺失表型，而且纤维素的合成受到抑制[11]。在番茄中发现2个BAS1同源基因：CYP734A7和CYP734A8，它们与BAS1 氨基酸序列的相似性分别为60%与69%。实验证实CYP734A7能够催化CS向 26-OH-CS的转化[12]，CYP734A8的功能尚不明确。2006年，在水稻中发现第一个BR失活基因OsCYP734A6，其T-DNA插入突变体表现出类似BRs处理的表型，同时內源BRs合成基因OsDWARF4下调[13]。随后，Sakamoto等从水稻基因组中分理出4个拟南芥BAS1同源基因：CYP734A2、CYP734A4、CYP734A5和CYP734A6，其中CYP734A2、CYP734A4与CYP734A6三者间氨基酸序列相似性高(70.2%～82.1%)，都能够催化CS和其他C-22羟化中间产物26位碳的羟基化，各自过表达后表现出典型的BRs缺失表型，但三者与CYP734A5间的同源性仅有58.0%～58.9%[14]，CYP734A5的功能目前尚不明确。

目前有关BR失活基因的研究主要集中在拟南芥等少数几种植物中，且研究结果初步表明BRs失活基因无论是数目还是功能都存在很大的物种差异。粮食作物青稞能够适应高原地区寒冷、紫外线强、有机物积累时间短等诸多恶劣自然条件，必然离不开植物激素的调控。因此，研究青稞中BRs失活基因的功能，不仅是对BRs代谢通路的拓展，而且对深入研究BRs与青稞抗逆性间的关系具有重要理论意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验材料青稞农家品种‘肚里黄’由青海省遗传重点实验室提供。

实验所用油菜素唑(brassinazole, BRZ)购自合肥博美生物科技有限责任公司，24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide, 24-eBL)购自上海实验室设备有限公司，限制性内切酶、抗生素等常规药品购自生工生物工程(上海)股份有限公司；植物RNA提取试剂盒、反转录试剂盒以及荧光定量试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司(Takara)；凝胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；引物合成与DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 24-eBL和BRZ处理对青稞幼苗的影响选饱满的‘肚里黄’种子，用20%的过氧化氢消毒后加入去离子水在黑暗中25 ℃条件培养36 h。随后，转入装满有1/5 MS+0.1 mg/L 24-eBL、或5 mg/L BRZ、或空白对照的10 mL离心管中，置于室温(22 ℃)条件下正常光照(16 h光/8 h暗)液体培养，每个处理20颗。5 d后直尺量取幼苗的株高，所得数据用origin软件进行处理并做图。

1.2.2 基因克隆青稞苗种植方法同1.2.1，参考TaKaRa-RNA提取试剂盒说明书，分别提取7与21 d苗龄的青稞根部总RNA，反转录后进行PCR扩增。扩增引物参考大麦中其同源基因序列设计，具体见表1。反应体系为50 μL，其中引物各1 μL、模板0.5 μL、酶25.0 μL。反应程序如下：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 8 min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，按试剂盒说明书进行目的片段回收。用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切表达载体pCAMBIA1302，将目的片段与线性化载体连接后立即进行转化DH5α感受态细胞，在含Kan抗生素平板上筛选阳性克隆，并采用菌落PCR方法进行阳性克隆验证，所用引物和程序同上。将阳性克隆送公司测序。

表1 引物序列信息

1.2.3 生物信息学分析将测序获得的序列在NCBI中blast分析其同源序列，并找出其完整开放阅读框(ORF)。对其编码蛋白质大小、等电点、亚细胞定位以及进化保守型进行分析预测，所用工具见表2。选用DNAMAN软件进行氨基酸序列多重对比和系统发育进化树构建。

表2 生物信息学分析网站

1.2.4 表达分析同1.2.1进行青稞幼苗的培养，取BRZ处理4 d的青稞幼苗全株用于目标基因表达分析，分别取正常生长条件下5、10及15 d的青稞幼苗的根和叶，用于目标基因表达分析，每个样品取3个生物学重复。所有样品总RNA提取与cDNA合成方法同1.2.2。运用表1中实时定量PCR引物，PCR程序与反应体系参考荧光定量试剂盒说明书。实验样品与内参(HvActin)均设置3个技术重复，采用2-ΔΔCt法进行相对表达量计算。

2 结果与分析

2.1 外源24-eBL、BRZ处理对青稞幼苗的影响

分别用人工合成生长调节剂24-eBL和BRs合成抑制剂BRZ处理青稞幼苗，4 d后观察统计幼苗高度，结果发现：与对照相比，施加24-eBL能够有效促进青稞幼苗的生长，而BRZ处理后幼苗长势明显减缓(图1)。

2.2 HvBAS1基因克隆与生物信息学分析

本研究发现，青稞中存在2个BAS1同源基因HvBAS1-1和HvBAS1-2。为了深入研究它们的功能，克隆其cDNA序列并测序(图2)。

生物信息学分析结果显示：HvBAS1-1的ORF全长1 629 bp，编码一条542个氨基酸的肽链，肽链分子量为60 932.18 kD，等电点为9.85；HvBAS1-2的ORF为1 689 bp，编码肽链含562个氨基酸，分子量为63 083.94，等电点为9.33。氨基酸序列比对发现二者相似性达76.42%(图3)，亚细胞定位在线预测结果显示二者均存在于内质网。

除了青稞，近年来，在水稻、番茄、玉米等植物中均已找到拟南芥BAS1的同源基因，氨基酸保守序列分析显示，它们均属于细胞色素P450家族的734A亚家族。进一步分析进化关系可知(图4)：在单、双子叶植物间出现了明确的分支，而青稞作为单子叶植物， HvBAS1-1和HvBAS1-2分别与水稻中的CYP734A4和CYP734A2比较接近。

2.3 表达分析

BRZ是一种油菜素类固醇激素合成抑制剂，BRZ处理青稞幼苗后，实时定量PCR检测HvBAS1-1与HvBAS1-2表达变化情况，结果如图5，A所示：HvBAS1-1与HvBAS1-2的转录水平均受到BRZ的下调，且HvBAS1-2更为明显。

HvBAS1-1与HvBAS1-2在青稞中的表达模式存在很大差异。分别选择5、10及15 d的青稞，实时定量PCR检测它们在根和莲座叶中的表达变化情况，结果图5，B、C所示，HvBAS1-1根中的表达量高于叶中，而HvBAS1-2恰好相反。此外，随着苗龄的增大，HvBAS1-1在根中的表达呈现出先升高后降低的趋势，HvBAS1-2在叶片中的先降低后升高。整体来看，HvBAS1-1与HvBAS1-2表达模式完全不同。

3 讨 论

BRs具有促生长、提高抗逆性的功能，这在棉花、葡萄、黄瓜等多种植物均已有探索[15-17]，但在青稞中尚未研究。本研究中通过外源施加人工合成的24-eBL与BRZ确定BRs也能促进青稞幼苗的生长，且效果非常显著，这意味着利用BRs相关基因改良青稞具有很大的潜力。

作为一种非常重要的植物激素，BRs的合成和代谢受到精细的调控。当体内BRs过多时，植物通过反馈机制降低BRs的合成，促进BRs的失活。拟南芥中研究发现，BRs信号转录因子能够直接结合到多个BRs合成和代谢基因的启动子区域, 从而调节这些基因的表达[18]，BAS1就是其中一个关键基因，BR信号能够通过转录因子ATAF2与BAS1的启动子结合，抑制其表达[19]。在青稞中，我们找到了拟南芥BAS1的同源基因HvBAS1-1和HvBAS1-2，当我们用BRs合成特异性抑制剂BRZ处理后，二者的表达均下调，这一结果意味着HvBAS1-1和HvBAS1-2很可能都参与青稞内源BRs的失活。

拟南芥BAS1的同源基因的数目在青稞中增加到2个，而在其他已有研究的物种中数目不等：胡萝卜和马铃薯中都仅有1个[11, 20]，水稻中有4个[21]，番茄中有2个[12]。尽管从功能上来看，这些基因中除了水稻CYP734A5外，都参与了BRs的失活，但这种数目的变化在物种间并未找到明显规律。然而，根据氨基酸序列信息进行进化分析时发现，他们在单、双子叶植物间出现了明确的分支。

青稞中为何存在2个拟南芥BAS1同源基因？这可能是因为HvBAS1-1和HvBAS1-2与拟南芥BAS1的功能并不完全相同。从氨基酸序列上来看，HvBAS1-1与水稻CYP734A4相似性最高，为81.54%；HvBAS1-2与水稻CYP734A2相似性最高，为81.50%；而他们与拟南芥BAS1相似性分别仅有55.72%与55.95%，这意味着HvBAS1-1和HvBAS1-2的功能很可能更接近水稻CYP734A4与CYP734A2，而非拟南芥BAS1。更有证据表明拟南芥和水稻内源BRs的代谢存在很大的差异，举例来说，拟南芥中有CS和BL两种活性终产物，而在水稻中仅有CS[8]。此外，CYP734A4和CYP734A2作为多功能、多底物酶，都能够催化诸多C-22羟基化中间体C-26的羟基化，导致过表达水稻都表现出典型的BRs缺乏表型，但二者对底物的偏好性并不相同[21]，这意味着HvBAS1-1与HvBAS1-2的功能很可能也存在差异。在本研究中，HvBAS1-1和HvBAS1-2的表达水平及时空性都不相同，这也进一步验证了上述推测。

CYP734A亚家族成员在进化的过程中除了数目发生变化外，在功能上可能也出现了分化，比如，胡萝卜DcBAS1除了参与 BR失活外，还能抑制纤维素的合成[21]，而水稻CYP734A5和番茄CYP734A8虽然也属CYP734A亚家族，但他们并不能催化BRs失活，具体功能目前尚不清楚。这意味着HvBAS1-1和HvBAS1-2除了参与BRs失活外可能还具有其他的功能。