去甲肾上腺素转运体和多巴胺转运体在甲基苯丙胺成瘾致大鼠心肌损伤中的作用及机制

赵夏浦，姚志军，涂婉玉，董 磊，张腾腾，刘 奔，任明芬

(1.新乡医学院第二附属医院，河南 新乡 453002；2.新乡医学院法医学院新乡市法医毒理学重点实验室，河南新乡 453003；3.新乡医学院基础医学院/河南省医用组织再生重点实验室，河南 新乡 453003)

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)是一种强效的中枢神经系统兴奋剂，被列为第一类精神药物[1]。MA重复摄入易造成药物成瘾，而药物成瘾是一种与奖赏作用和学习记忆有关的慢性复发性脑病[2]，可改变大脑的结构与功能[3]，对各个脑区造成严重损害。目前，关于MA成瘾的神经毒性机制已经较为明确，但其对心脏的毒性作用及机制尚不明确。条件性位置偏爱(conditioned place preference，CPP)动物模型是用来研究与奖赏相关的学习、记忆功能的经典动物模型[4]，能够较好地模拟MA成瘾者的行为特征[5]，且CPP效应的缓解与成瘾性药物的戒断治疗具有同等效果[6]。本研究拟通过CPP制备MA成瘾大鼠模型，观察MA成瘾模型大鼠心脏组织学变化及心肌组织中去甲肾上腺素转运体(norepinephrine transporter，NET)和多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)表达的变化，探讨MA成瘾对大鼠的心脏毒性作用及机制，旨在为进一步研究MA成瘾对心脏的毒性作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体级8周龄健康Sprague Dawley(SD)雄性大鼠17只，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2019-0010，体质量230～250 g。对动物的实验处理方法遵照中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂与仪器MA购自中国食品药品检定研究院(批准文号171212-201605)，NET一抗和DAT一抗购自上海安研商贸有限公司，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒购自武汉赛维尔生物公司，免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)检测试剂盒购自北京中杉金桥生物公司；正置光学显微镜购自日本Nikon公司，冷冻切片机购自日本Leica公司，CPP实验视频分析系统由上海移数信息科技公司提供。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及处理将17只SD大鼠随机分为对照组(n=7)和MA组(n=10)。2组大鼠均单笼饲养，整个实验过程自由饮水取食。将MA用生理盐水配制成5 g·L-1MA溶液。MA组大鼠分别于实验第 5、7、9、11、13、15、17天腹腔注射5 g·L-1MA溶液(1 mL·kg-1)，第6、8、10、12、14、16、18天腹腔注射生理盐水(1 mL·kg-1)；对照组大鼠每日腹腔注射生理盐水(1 mL·kg-1)。

1.3.2 CPP实验第1～4天为适应期，每日将大鼠放入CPP箱中，将黑白箱中间的隔板取出，让其在黑白箱中自由活动30 min适应CPP箱环境；然后对每只大鼠进行CPP测试15 min，确定大鼠的天然偏爱箱。第5～18天为训练期，封闭CPP箱中间的隔板，2组大鼠腹腔注射MA溶液或生理盐水后放入CPP箱训练120 min，连续训练14 d，于第19天对2组大鼠进行CPP测试15 min，记录大鼠在白箱中停留时间和活动轨迹，分析活动轨迹曲线密度。在每个阶段CPP测试过程中，保持安静，每只大鼠训练或测试结束后对CPP箱底部及侧壁喷洒酒精并清洁，并保证实验条件、时间、环境的一致。

1.3.3 心脏组织取材和处理实验第19天，2组大鼠以20 g·L-1的戊巴比妥钠(60 mg·kg-1)麻醉，然后依次用200 mL生理盐水和200 mL多聚甲醛溶液(4 g·L-1)行心脏灌流，取左心室，置于4 g·L-1多聚甲醛中室温固定24 h，使用冰冻切片包埋剂包埋，连续切片(厚 10 μm)，组织切片用于后续HE染色和IHC检测。

1.3.4 HE染色观察2组大鼠左心室心肌组织病理学变化冰冻切片45 ℃ 烤片2 h，在摇床上洗5 min 洗去包埋剂。苏木精染液染色5 min，自来水冲洗多余染色液；然后用体积分数1 %的盐酸乙醇分化30 s，再用自来水充分洗涤。将组织切片置于体积分数0.5 %的伊红乙醇溶液中复染2 min，依次在体积分数75 %的乙醇脱水2 min、体积分数85 %的乙醇脱水30 s；再依次在无水乙醇中彻底脱水2次，每次2 min；然后将组织切片依次移入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡各3 min至切片透明，中性树胶封片。应用正置光学显微镜观察心脏组织的形态学变化。

1.3.5 IHC法检测2组大鼠左心室心肌组织中NET和DAT的表达取心脏组织冷冻切片，复温5 min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)浸洗3次，每次 5 min；用体积分数3%过氧化氢抗原封闭，PBS浸洗3次，每次5 min；室温下滴加适量的内源性过氧化物酶阻断剂，孵育10 min，PBS浸洗3次，每次5 min；滴加体积分数5%山羊血清封闭，37 ℃孵育30 min，倾去血清；分别滴加兔抗大鼠多克隆NET一抗(滴度1200)和兔抗大鼠多克隆DAT一抗(滴度1200)，4 ℃过夜。37 ℃恒温箱复温30 min，磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered solution，PBST)浸洗3次，每次5 min，滴加山羊抗兔IgG标记的二抗，37 ℃孵育60 min，PBST浸洗3次，每次5 min。使用IHC试剂盒进行染色。使用Image J Basies Version 1.53软件测量切片阳性免疫反应区域的积分光密度(integral optical density，IOD)值，计算平均光密度值(average optical density，AOD)，AOD=目标分布区域IOD值/目标分布区域的面积，以AOD代表目标物质相对表达量。每只大鼠取3个不同层面的3张切片进行分析，取均值。

2 结果

2.1 2组大鼠白箱中停留时间和活动轨迹曲线密度比较实验第19天，对照组和MA组大鼠白箱中停留时间分别为(404.478±87.512)、(165.433±27.323)s；MA组大鼠白箱中停留时间显著长于对照组，差异有统计学意义(t=6.295，P<0.05)。MA组大鼠在白箱中的活动轨迹曲线密度明显高于前测期，对照组大鼠在白箱中的活动轨迹曲线密度无明显变化(图1)。

图1 2组大鼠CPP测试轨迹图

2.2 2组大鼠左心室心肌组织病理学变化比较结果见图2。对照组大鼠左心室心肌细胞排列整齐，未见心肌损伤表现；MA组大鼠左心室心肌细胞排列紊乱，可见心肌组织出血、心肌细胞波纹样改变、心肌内炎症细胞聚集。

A:对照组大鼠正常心肌组织；B:MA组大鼠心肌组织内出血；C:MA组大鼠心肌细胞呈波纹样；D：MA组大鼠心肌组织中可见炎症细胞。

2.3 2组大鼠左心室心肌组织中NET、DAT相对表达量比较结果见表1和图3。免疫组织化学染色显示，NET和DAT阳性表达为棕黄色染色，定位于左心室心肌细胞膜。MA组大鼠左心室心肌组织中NET和DAT相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组大鼠左心室心肌组织中NET和DAT相对表达量比较

A:对照组大鼠心肌组织中NET的表达；B:MA组大鼠心肌组织中NET的表达；C:对照组大鼠心肌组织中DAT的表达；D：MA组大鼠心肌组织中DAT的表达。

3 讨论

MA成瘾性强、复吸率高，故其滥用已成为严重的公共卫生问题和社会问题[7]。MA是一种间接的拟交感神经药物[8]，可通过冠状动脉收缩压持续升高[9]以及氧自由基大量累积[10]对中枢神经系统和心血管系统产生不良影响。MA对心血管系统造成的毒副作用已成为MA滥用者死亡的重要原因[11]。研究发现，MA成瘾对神经系统的影响与大脑中NET和DAT的表达和调控密切相关[12]，但目前MA对心血管系统的影响尚不清楚[13]。

本研究通过给予大鼠MA结合CPP训练制备MA成瘾模型，结果显示，MA组大鼠在白箱中停留时间显著长于对照组，MA组大鼠给药后在白箱中活动轨迹曲线密度明显高于前测期，而对照组大鼠在白箱中活动轨迹曲线密度无明显变化；说明MA可以使大鼠产生明显的CPP效应，对MA产生躯体和精神依赖，证实造模成功。此外，本研究结果显示，对照组大鼠左心室心肌细胞排列整齐；MA组大鼠左心室心肌细胞排列紊乱，可见心肌出血、心肌细胞波纹样改变、心肌内炎症细胞聚集；说明MA可引起大鼠左心室心肌细胞坏死、变性及心肌组织炎症反应等病理变化，对大鼠心肌组织有一定的损伤作用。

NET可高密度地表达于去甲肾上腺素能神经元质膜上，也表达于胶质细胞中[14]，其通过调节突触间隙释放的去甲肾上腺素水平，在许多中枢和外周神经系统生理机制中发挥关键作用，NET功能障碍已被证明与注意缺陷多动障碍、恐慌、抑郁症等多种中枢神经系统疾病相关。在外周神经系统中，NET对心血管稳态至关重要，NET功能障碍通常与高血压[15]、体位性心动过速综合征[16]、立位不耐受和心力衰竭[17]等心血管病变中交感神经过度活动有关。DAT可将多巴胺从细胞外迅速转运到突触前神经元细胞质中，以维持多巴胺稳态[18]，DAT功能异常参与注意力缺失过动症、DAT缺乏综合征、孤独症、精神分裂、药物成瘾及帕金森病等多种神经和精神疾病的发生[19]。研究表明，MA和其他精神兴奋剂作用于NET和DAT，可破坏去甲肾上腺素和多巴胺的再摄取[20]。本研究结果显示，对照组和MA组大鼠心肌组织中均有NET、DAT的表达，而MA组大鼠心肌组织中NET、DAT相对表达量显著低于对照组。这一结果说明，MA成瘾可造成心脏组织中NET和DAT表达降低，从而造成对儿茶酚胺的清除减少[12]，导致突触后儿茶酚胺水平激增，引起血管痉挛、缺血、活性氧产生以及线粒体损伤等，最终造成心肌损伤[21]。有研究报道，静脉注射三硝基去甲肾上腺素过程中，三硝基去甲肾上腺素在心脏中的分布比例远远超过在肾脏、前臂、腿部、大脑和肺部，提示NET功能缺陷可能会增强交感神经化学信号，增加情感性疾病个体心血管疾病发展的风险[22-23]。

综上所述，MA成瘾可通过降低心肌组织中NET和DAT表达水平，导致心肌损伤。但本研究未检测突触后儿茶酚胺水平变化，NET和DAT表达变化对突触后儿茶酚胺水平的确切影响尚未证实，这需在今后的实验中进行研究；而且未来可对心脏损害和MA用药时间的关系进行研究，以指导临床对MA成瘾导致的心肌损伤进行预防和治疗。