预知子联合雷公藤红素对肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用及对NF-κB通路的影响

张夜航，彭佩克，方肇勤，卢文丽

上海中医药大学基础医学院，上海201203

原发性肝癌（以下简称“肝癌”）在全世界常见36种恶性肿瘤中发病率居第6位，致死率居第3位。肝癌起病隐匿，增殖迅速，临床多数患者在诊断时已为中晚期或出现转移，需要接受除手术、介入等手段外的全身性系统治疗，中医药是系统治疗的重要组成部分。课题组前期体外实验研究发现，行气活血法代表中药预知子醇提物能有效抑制多种肝癌细胞增殖，联合雷公藤红素具有协同增效作用，能诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期，然而其体内作用效果尚不清楚。核因子（NF）-κB通路是与肿瘤和炎症密切相关的经典通路，雷公藤红素在多种肿瘤研究中显示对该通路的抑制作用，且多有联合用药探索，而预知子对该通路的影响较少涉及。因此，本研究通过建立SMMC7721肝癌荷瘤裸鼠模型，观察预知子联合雷公藤红素对肿瘤生长影响，并从NF-κB通路探讨二者联合的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞

雄性Balb/c裸鼠30只，体质量16～18 g，购自上海西普尔-必凯实验动物公司，饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF 级实验室，使用许可证号SYXK（沪）2020-0009。本研究经上海中医药大学实验动物伦理委员会审批（PZSHUTCM201120006）。人肝癌SMMC7721细胞，购自中国科学院上海细胞库。细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5%CO培养箱中培养，3～4 d 传代1 次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2 药物及制备

预知子药材1 000 g，上海康桥中药饮片有限公司，批号200723，获取种子208 g，60 ℃干燥过夜，粉碎，加入10倍体积50%乙醇浸泡2 h，80 ℃回流提取2次，每次2 h，合并回流液，过滤，浓缩至膏状、无醇味，冻干，得冻干粉47 g，置于-80 ℃冰箱保存备用。雷公藤红素，美国MedChemExpress公司，批号78528。参考文献[10-11]方法，称取一定量壳聚糖粉末，磁力搅拌下溶解于0.1 mol/L盐酸溶液中，4 ℃过夜充分溶胀并除去气泡，次日4 000 r/min离心10 min去除杂质，置于4 ℃冰箱备用。称取一定量甘油磷酸钠粉末，于双蒸水中充分溶解，置于4 ℃冰箱备用。于4 ℃向壳聚糖溶液中逐滴加入甘油磷酸钠溶液，继续搅拌约10 min，即得空白壳聚糖/甘油磷酸钠凝胶溶液。将适量预知子冻干粉溶于甘油磷酸钠溶液，4 ℃下逐滴加至壳聚糖溶液，使其终浓度为60 mg/mL；将一定量雷公藤红素溶于二甲基亚砜，逐滴加至壳聚糖溶液中，再向该溶液中滴加甘油磷酸钠溶液，摇晃混匀，使其终浓度为0.33 mg/mL；同法制成含相同浓度的预知子提取物和雷公藤红素的混合溶液，置于4 ℃冰箱备用。

1.3 主要试剂与仪器

RPMI 1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美国Corning 公司，批号分别为33920003、26219003、22420008），壳聚糖（生工生物工程上海股份有限公司，批号G925BA0023），PageRuler预染蛋白ladder（美国Thermo Scientific，批号00792185），青霉素-链霉素、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为C0222、A0216、P0013B、P1005、P1045-2），超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号120319201009），小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号241171031026），β-甘油磷酸二钠（美国Merck，批号BCCD6874），NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）一抗、周期蛋白D1（Cyclin D1）一抗、周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）一抗（英国Abcam，批号分别为GR3275776-6、GR275907-38、GR3233421-7、GR3302404-8），p-NF-κB p65（Ser536）一抗、p-IκBα（Ser32/Ser36）一抗（美国Affinity Biosciences，货号AF2006、AF2002），IκB激酶α一抗（IKKα，上海碧云天生物技术有限公司，批号121918211028），β-actin单抗（美国Affinity Biosciences公司，批号85r7978）。Alpha 1-2 LD plus 冷冻干燥机（德国CHRIST），CP2250 分析天平（德国Sartorus 公司），MH-1 摇床（海门其林贝尔仪器），Model 310 CO培养箱、1300 SERIES A2 生物安全柜、HPS RT2 加热磁力搅拌器（美国Thermo Scientific公司），ELX-800全自动酶标仪（美国Bio-Tek公司），XDS-1B倒置显微镜（重庆光学仪器厂），PowerPacBasic 电泳仪及配套电泳槽、170-3930 小型湿转槽（美国Bio-Rad 公司），FluorChem E 凝胶成像与分析系统（美国Protein-Simple公司），Tissuelyser-64L多样品组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）。

1.4 造模、分组及给药

裸鼠适应性饲养3 d后，每只右腋皮下接种0.2 mL SMMC7721细胞悬液（1.5×10个/mL）。7 d后待肿瘤长出，随机将裸鼠分为模型对照组、预知子提取物组（0.30 g/kg）、雷公藤红素组（1.67×10g/kg）和联合组（以上剂量联合），分别为7、7、8、8只，分别于分组后第1、6、11日经皮瘤内注射相应药物，每次100 μL，共3次。

1.5 指标检测

1.5.1 一般情况

每2日观察裸鼠饮食、活动及生长状况，称量裸鼠体质量，计算瘤体积（0.5×a×b，a为长径，b为宽径）。第16日脱颈处死动物，取瘤组织后称定质量，计算瘤指数和抑瘤率，瘤指数＝瘤质量÷去瘤体质量，抑瘤率（%）＝（模型对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量）÷模型对照组平均瘤质量×100%。取肝、脾、左肾并称重，计算脏器指数，脏器指数＝脏器质量÷去瘤体质量。

1.5.2 ELISA检测

第16日处死动物前，摘眼球取血，4 ℃静置2 h，2 000 r/min离心20 min，取血清，按ELISA试剂盒说明书操作，检测血清TNF-α含量。

1.5.3 HE染色

将瘤组织置于10%福尔马林溶液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，60 ℃浸蜡2 h，切片机切片（厚度约5 μm），37 ℃恒温箱中烘干过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水洗后，苏木素染色5 min，蒸馏水浸洗，伊红染色1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，正置显微镜下观察并拍照。

1.5.4 Western blot检测

取瘤组织，加入RIPA裂解液（含磷酸酶和蛋白酶抑制剂）裂解，采用磁珠粉碎后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液测定蛋白浓度；蛋白上样量约30 μg，电泳，蛋白转移至0.45 μm PVDF膜，5%BSA室温封闭2 h，加入IKKα一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶2 000）、p-NF-κB p65 一抗（1∶1 000）、IκBα 一抗（1∶2 000）、p-IκBα 一抗（1∶1 000）、Cyclin D1一抗（1∶20 000）、CDK2一抗（1∶5 000）、β-actin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，滴加二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，ECL显色曝光，用FluorChem E凝胶成像与分析系统获得条带，Image J软件计算条带灰度值，以β-actin为内参，计算蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 预知子联合雷公藤红素对荷瘤裸鼠一般状况的影响

实验过程中，模型对照组死亡2只、雷公藤红素组死亡1只，其余2组未出现动物死亡。

各组裸鼠初始（第1日）体质量及瘤体积差异无统计学意义（＞0.05）；实验第16日，与模型对照组比较，雷公藤红素组裸鼠体质量、去瘤体质量、瘤质量、瘤指数、瘤体积显著减少（＜0.05），联合组裸鼠瘤质量、瘤体积显著减少（＜0.05）。预知子提取物组、雷公藤红素组、联合组抑瘤率分别为6.68%、35.08%、22.00%。见表1。

表1 各组裸鼠一般状况比较（）

与模型对照组比较，预知子提取物组、雷公藤红素组、联合组裸鼠肝质量、肝指数、左肾质量显著降低（＜0.05），预知子提取物组和雷公藤红素组裸鼠左肾指数显著降低（＜0.05）。见表2。

表2 各组裸鼠脏器质量和指数比较（）

2.2 预知子联合雷公藤红素对荷瘤裸鼠血清肿瘤坏死因子-α含量的影响

与模型对照组比较，各给药组裸鼠血清TNF-α含量显著增加（＜0.05），各给药组间差异无统计学意义（＞0.05）。见表3。

表3 各组裸鼠血清TNF-α含量比较（，pg/mL）

2.3 预知子联合雷公藤红素对荷瘤裸鼠瘤组织形态的影响

模型对照组裸鼠肿瘤细胞大小不一，部分区域出现坏死、细胞核消失、炎性细胞浸润，可见少量巨噬细胞；预知子提取物组裸鼠瘤组织核深染细胞和炎性细胞较少，但有间质增多现象；雷公藤红素组裸鼠瘤组织也出现间质增多、核深染及炎性细胞减少现象，同时部分区域细胞排列疏松，细胞核变小甚至消失；联合组裸鼠肿瘤细胞大小不一、排列相对无序，间质增多依然存在，坏死区域出现明显炎性细胞浸润堆积。见图1。

图1 各组裸鼠瘤组织形态（HE染色，×200）

2.4 预知子联合雷公藤红素对荷瘤裸鼠核因子-κB通路相关蛋白表达的影响

2.4.1 对上游IKKα 和下游CDK2、Cyclin D1 蛋白表达的影响

与模型对照组比较，雷公藤红素组裸鼠瘤组织IKKα、CDK2、Cyclin D1 蛋白表达显著降低（＜0.05），且与预知子提取物组和联合组比较差异有统计学意义（＜0.05）。见图2。

图2 各组裸鼠瘤组织IKKα、CDK2、Cylin D1蛋白表达比较（，每组3～6只）

2.4.2 对IκBα、NF-κB p65蛋白表达的影响

与模型对照组比较，联合组裸鼠瘤组织IκBα、p-IκBα蛋白表达显著降低（＜0.05），雷公藤红素组裸鼠瘤组织NF-κB p65蛋白表达显著降低（＜0.05），各给药组瘤组织p-NF-κB p65蛋白表达有下降趋势，但差异无统计学意义（＞0.05）。见图3。

图3 各组裸鼠瘤组织IκBα、NF-κB p65蛋白表达比较（，每组3～6只）

3 讨论

对于恶性肿瘤、慢性病等难治性疾病，因单药治疗在耐药性及不良反应等方面存在局限性，单一靶点、单一药物的常规治疗策略已经逐渐转向多成分、多靶点的联合疗法，且具有减量、增效、减毒等优势。虽然联合用药理念成为共识，但传统全身给药方式疗效不佳，局部或靶向治疗可能成为未来肿瘤治疗的新方向。局部或靶向治疗需要媒介，可注射温敏性载药系统，如壳聚糖/甘油磷酸钠载药系统。该系统能在低温下保持液态、体温下形成凝胶，且具有良好的生物相容性、降解性、可控缓释等特点，许多研究者尝试将该系统用于实验动物肿瘤局部给药，以形成局部给药储存和缓释系统，达到较好的抑制肿瘤细胞增殖效果。本实验根据前期体外实验结果，借助可注射温敏性壳聚糖/甘油磷酸钠载药系统，将预知子提取物和雷公藤红素共载，观察局部联合给药对肿瘤生长的抑制作用，并分析可能的作用机制。

本研究结果显示，给药干预总体呈积极效应。从动物生存情况分析，模型对照组死亡2只，推测与肿瘤不断生长、动物负荷增加、局部压迫和应激有关；雷公藤红素组死亡1只，而预知子提取物组和联合组均未出现动物死亡。从抑制肿瘤生长上分析，3个给药组按抑瘤率由高到低排序依次为雷公藤红素组、联合组、预知子提取物组，即抑瘤率以雷公藤红素最高，但同时在3个给药组中，雷公藤红素组裸鼠生存情况较差，肝、肾质量和指数及去瘤体质量等均较低，而联合组在一定程度上能纠正以上变化。此外，研究还发现，各给药组裸鼠血清TNF-α含量增加，但各给药组间无显著差异，还需综合其他血清学指标如白细胞介素-6、白细胞介素-1β等辅助判断。同时，瘤组织HE染色结果提示，经预知子提取物或雷公藤红素作用后，局部细胞形态学发生改变，且联用后炎症、坏死程度加重。

有研究表明，可通过影响NF-κB通路活性，如抑制IκBα蛋白磷酸化，从而影响肝癌预后。在其他肿瘤研究方面，NF-κB抑制剂雷公藤红素与组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA 联用可抑制SAHA 单药引起的NF-κB激活，既有协同抗肺癌活性又未增加毒性。还有研究将多烯紫杉醇与雷公藤红素共载，用于治疗乳腺癌荷瘤小鼠，发现多烯紫杉醇对NF-κB p65等蛋白表达影响不大，而雷公藤红素对该通路有较好抑制作用，最终发挥协同抗肿瘤作用。本研究中，单用雷公藤红素能抑制NF-κB通路，包括NF-κB p65、上游IKKα以及下游CDK2、Cyclin D1分子；单用预知子提取物对该通路影响不大，但与雷公藤红素联合后又能一定程度逆转雷公藤红素引起的相应变化。这些分子水平的变化，与各组去瘤体质量、抑瘤率等指标变化趋势基本一致。此外，预知子提取物组和雷公藤红素组p-IκBα水平总体呈下降趋势，且在联合组呈现显著下调趋势。因此，推测p-IκBα可能是二者联合发挥作用的重要靶点之一。

现有给药方式和剂量条件下，就抑制肿瘤增殖效果而言，预知子提取物作用并不十分显著，雷公藤红素最为突出，联合组居中。此结果与体外实验联合组抑瘤效应最强不完全一致。可能与本研究采用的壳聚糖/甘油磷酸钠载药系统有关。该载药系统对于预知子提取物冻干粉载药有限，而对于雷公藤红素却有较大的容许空间，一定程度上限制了预知子药效发挥，也影响了预知子和雷公藤红素的剂量比例，而剂量比例直接影响能否发挥最大联合作用。鉴于目前文献所载药物多为中药单体，如紫杉醇、去甲斑蝥素、姜黄素等。因此，今后可以将预知子提取物进行进一步萃取、提纯，明确其发挥药效的物质基础；另一方面，可以考虑优化载药体系，如采用脂质体、纳米颗粒等微载体系统，优化二者抑制肝癌细胞增殖的联合作用，拓展肝癌协同用药研究空间。