糖尿病视网膜病变中视网膜内皮细胞功能障碍的研究进展△

孔 慧 崔 彦

糖尿病视网膜病变(DR)是一种临床定义明确、威胁视力的慢性微血管并发症，尽管随着视网膜神经血管单位(RVUT)定义的提出，认为神经元的损伤出现在微血管改变之前，DR的临床可见特征仍是视网膜微血管系统的改变，包括视网膜不灌注、血管通透性增加，以及病理性眼内血管增生[1]。视网膜内皮细胞(REC)被认为是糖尿病诱导的血管损伤的主要细胞靶点，在不同血糖控制情况、糖尿病持续时间和有无DR的糖尿病患者中，REC的数量和功能存在差异。退化性毛细血管是早期DR的一个标志，是REC和周细胞共同丢

失的结果，失去细胞的血管随后转化为缺乏血流的基底膜管，由此产生的缺血可能促进了以视网膜新生血管为特征的增生型糖尿病视网膜病变(PDR)的发生[2]。DR时RVUT发生炎症级联反应[3]，胶质细胞分泌炎症因子，REC发生程序性死亡[4]。本文结合近年来关于体内外REC的实验研究，探讨DR中高糖等各种病理因素引起的REC结构和功能变化及这些变化发生的具体机制，并分析其病理改变在DR发生发展中的作用。

1 REC在视网膜血管系统中的结构和功能

视网膜毛细血管由一层REC组成，细胞-细胞接触紧密，形成血-视网膜内屏障(iBRB)，生理状态下健康的REC不仅发挥着血管被动屏障的作用，而且还发挥着许多重要的生理功能，包括介导血管活性因子的释放，调节血管壁张力、细胞生长、内稳态和炎症状态。在体内，REC一方面必须确保向代谢活跃的视网膜提供氧气和营养物质，并允许进入视网膜的循环免疫细胞检查是否存在潜在病原体；另一方面通过排除循环分子毒素、微生物和促炎白细胞来维持iBRB，保护视网膜[5]。因此REC是视网膜缺血性疾病的主要参与者，包括DR。

虽然没有专门的研究确认，但REC很可能具有协助壁肌细胞和周细胞感知和传导机械力的作用。视网膜内皮上包覆有一个糖萼，这个结构在内皮细胞和循环血细胞之间相互作用，调控血管紧张度，被认为起到机械传感器的作用。REC也能作为化学感受器，在缺氧和高碳酸血症时，通过产生包括一氧化氮、花生四烯酸代谢物和内皮素-1在内的分子介质来传达视网膜血管舒张或血管收缩的需求，调控血流动力[6]。作为iBRB的形成细胞，REC的显著特征是特殊的“闭塞带(ZO)”细胞间连接的存在，这些连接与邻近细胞形成稳定和极其紧密的结合，保证了循环血液中的物质不能够随意进入视网膜。

视网膜血管生成是正常血管发育的一部分，也是缺血性血管病变中视网膜新生血管形成的关键组成部分。内皮细胞能够特化为尖细胞(tip cells)和柄样细胞(stalk cells),尖细胞迁移与星形胶质细胞突起一起延伸丝状足。在每个尖细胞的后面，柄样细胞增殖生长成内皮芽启动血管的形成[7]。邻近细胞间通过Notch系统调控VEGFR-1和VEGFR-2的相对表达竞争成为能够促进血管网络分支的尖细胞。毛细血管中的内皮细胞不是静态的，而是通过细胞间信号通路动态改变的，相邻内皮细胞之间的信号通路在血管的发育、重塑和稳态中起着重要作用。Notch受体及其配体Dll4和Jagged1调节内皮细胞之间的动态和瞬时细胞间信号，糖尿病高糖状态会导致Notch信号改变[8]。

通过基因芯片分析血管内皮基因表达，证实了来自不同组织的内皮细胞、大血管与微血管内皮细胞、动脉与静脉内皮细胞之间存在异质性。血管内皮细胞的异质性同样在眼内存在，REC具有独特的分子表型。与脉络膜内皮细胞相比，REC中有779个转录本有差异表达，其中330个转录本在REC中相对高表达。REC表达了相对高水平的参与免疫反应的转录本，包括细胞间黏附分子、细胞因子、趋化因子、受体和参与合成炎症蛋白的酶，人REC表达了相对较高水平的IL-6转录本，在短暂接触脂多糖后该表达增加了近20倍[9]。REC同时参与应激、细胞增殖和黏附转录本的高表达，表明可能存在对缺血的独特反应和新生血管的特异性调节[5]。

2 DR时REC发生结构和功能变化

DR是一种慢性、进行性的低级别炎症性疾病,以REC死亡和血管炎症为特征，是糖尿病的常见微血管并发症。DR的早期特点是REC的凋亡和促炎改变，导致脱细胞毛细血管和血管通透性改变[10]。多种应激源已被证明可以触发REC迁移及凋亡，研究最广泛的是暴露于高糖和炎症因子。糖尿病的高血糖状态是视网膜细胞结构和功能损伤的主要因素，主要机制涉及糖基化终末产物、多元醇途径、PKC、氧化应激[11]。炎症是DR病理生理学中的另一个活跃因素[3]。在体内高血糖和高炎症因子水平的作用下，REC发生凋亡、细胞表型改变以及迁移能力增强，致使毛细血管通透性增加或毛细血管闭塞，分别导致黄斑水肿或视网膜新生血管形成。

视网膜生理结构的维持需要复杂的细胞间相互作用。这些相互作用发生在称为细胞连接的特殊接触位点，包括紧密连接[如闭合蛋白(occludin)和ZO]、黏附连接[如血管内皮钙黏蛋白(VE-钙黏蛋白)]和缝隙连接[如连接蛋白43(Cx43)]。iBRB中最丰富的网格蛋白亚型是Claudin-5，Claudin-5与ZO-1的PDZ结构域相互作用，ZO-1是一种大型支架蛋白，作为跨膜蛋白和细胞骨架之间的桥梁，ZO-1是BRB完整性的标志，ZO-1的丢失或减少与屏障渗透性的增加有关；其他亚型也在视网膜中表达，如Claudin-1，在糖尿病小鼠视网膜中的表达降低[12]。VE-钙黏蛋白在细胞黏附中起重要作用。DR时VEGF水平升高导致血管渗漏，同时VEGF激活PKC-β，使闭合蛋白磷酸化，磷酸化的occludin随后被泛素化靶向降解，导致血管通透性增加[13]。高糖时通过TLR4信号通路减少REC上的occludin和ZO-1的表达，破坏紧密连接[14]，导致REC通透性增加。在缝隙连接处，相邻的两个内皮细胞上各有一个半通道进行接触,半通道由6个连接蛋白组成。也通过调节occludin-5和ZO-1等紧密连接蛋白的表达和定位来参与屏障功能的调控。CX43是目前研究较多的半通道蛋白，体外高糖培养的人REC的CX43表达降低，进一步下调紧密连接和黏附连接[15]。在糖尿病大鼠视网膜中，iBRB渗漏增加，炎症因子(VEGF、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、MMP-9)表达显著增加，p38 MAPK、NF-κB和TXNIP的蛋白表达上调，而紧密连接蛋白(ZO-1、occludin、JAM-A、Claudin-5)表达显著降低；在体外实验中，褪黑素通过抑制p38/TXNIP/NF-κB通路上调紧密连接蛋白的表达，降低炎症因子的产生，从而维持iBRB的完整性[16]。这些在内皮细胞之间附着位点的连接也起到调节信号系统，维持细胞位置，通过接触抑制抑制生长，并保护细胞免受凋亡的作用[17]。

血管形成需要内皮细胞增殖和迁移，Notch信号通路很可能在成人血管稳态中起作用，并受到糖代谢失调的影响。Yan等[18]在糖尿病小鼠模型的毛细血管中识别出Jagged1/Notch信号的紊乱，认为内皮细胞的葡萄糖代谢会影响Notch信号转导和发育性血管生成。另外，高糖能以时间依赖性的方式诱导REC中的长链非编码RNA(lncRNA)-MIAT的表达，增强REC的增殖和迁移能力，导致病理性血管形成[8]。高糖激活Src、PI3K/Akt1/eNOS和ERKs通路并上调肝素酶增强了小鼠和人REC的迁移[19]。circHIPK3是一种新的环状RNA，作为一种内源性的miR-30a-3p海绵，可以隔离和抑制miR-30a-3p的活性，从而导致VEGF-C、FZD4和WNT2的表达增加，影响血管内皮生成功能，在糖尿病相关的应激源后，内皮细胞的circHIPK3表达显著上调；体外高糖培养人REC结果显示，circHIPK3表达增高使人REC的活力提高，增殖、迁移和促血管形成能力均增强[20]。此外，糖尿病环境中促炎细胞因子的上调可能通过靶向REC直接参与诱导血管形成，并通过诱导REC产生促血管生成介质来间接诱导血管形成。

3 DR中REC炎症和凋亡

视网膜内无细胞毛细血管的形成是DR的一个显著特征，是由REC和周细胞的凋亡引起的，促炎细胞因子诱导活性氧(ROS)和一氧化氮的形成，通过形成过氧亚硝酸盐，降低Hsp27含量，导致REC凋亡[21]。REC缺失预示着DR增殖前形式的视网膜损伤。REC凋亡发生在许多应激源的反应中，包括高糖、氧化应激、缺氧，最广泛的研究是暴露于高糖。在糖尿病动物模型中，视网膜血管暴露于高糖会引起细胞凋亡导致REC丢失[22]。动物体内晚期糖基化终末产物及ROS显著增加了细胞凋亡。DR中Caspase-3蛋白激活通过线粒体通路、Fas-FasL配体依赖通路，以及炎症介导的TNF、IL-1β通路这三种途径介导REC凋亡。

糖尿病患者和实验性糖尿病或半乳糖血症动物模型的REC的死亡增加[23]。然而在高糖诱导REC的体外研究中，得到了相互矛盾的结果。一些体外研究表明，暴露于高糖的REC活力降低，凋亡增加[19,24-26]。而另一些研究中，高糖对REC凋亡没有影响[27]，甚至促进细胞增殖[28-30]，间歇性高糖对人REC的增殖作用高于持续性高糖，高糖对培养过程中大血管和微血管内皮细胞的活力和凋亡具有不同的影响[28]。这些研究表明，REC对高糖的反应可能是复杂的，涉及直接和间接的影响，因此可能受到物种、细胞制备和培养条件等差异的影响。

也有观点认为,是细胞因子而不是高糖诱导REC中的炎症途径和凋亡变化，糖尿病相关内皮细胞损伤主要是由于葡萄糖诱导邻近细胞的细胞因子释放，而不是高血糖对内皮细胞本身的直接影响[3]。Busik等[27]发现，高糖诱导的炎症细胞因子增加导致REC的凋亡，比单纯的高糖诱导的更多。基底膜的一些成分(IV型胶原非胶原酶1结构域)也被认为可以抑制小鼠REC的增殖，并通过降低关键的抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2的水平以刺激细胞凋亡[31-32]。长期暴露于高糖会导致人REC衰老，增加群体倍增时间[33]。REC死亡可能导致毛细血管关闭，加速死亡和随之而来的内皮细胞加速更新将导致血管壁持续重塑，最终导致糖尿病视网膜血管的结构改变(微动脉瘤、扩张)，因为复制周转率的增加将过早地耗尽细胞的复制潜能[23]。

葡萄糖异常也是由NLRP3炎症小体介导的无菌性炎症反应的一个重要触发器。高血糖触发REC上调IL-1β的表达，IL-1β作为自分泌或旁分泌刺激REC或大胶质细胞中IL-1β的表达，从而导致IL-1β的持续过表达，IL-1β导致ROS的释放，并促进NF-κB易位到细胞核，从而产生持续的炎症反应。炎症小体3(NLRP3)是细胞内的先天免疫蛋白，能够和ASC、Caspase-1组装形成炎性蛋白复合物，促进TNF-α和IL-1β成熟和分泌，引起炎症性细胞焦亡。DR患者增殖膜中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表达升高，免疫荧光染色显示NLRP3和IL-1β共定位于REC[31]。体外高糖培养人REC，NLRP3、Caspase-1和IL-1β mRNA均显著增加，上清液IL-1β水平呈时间依赖性升高，炎症小体的特异性抑制剂MCC950及沉默NEK7能够抑制NLRP3炎症小体的激活，Caspase-1和IL-1β前体向成熟Caspase-1和IL-1β的转化[34]。高糖激活人REC中P2X7/NLRP3通路，促进炎症因子IL-1β的表达和释放[35]。高糖激活REC上的P2X7受体也能导致促炎介质TLR-4、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8以及VEGF-A和ICAM-1的表达增加，同时增强了ROS的产生[15]。糖尿病小鼠激活CD40受体通过Müller细胞释放ATP和上调P2X7双重机制诱导REC的凋亡[4]。

4 小结

REC和嵌在静脉和毛细血管的基底膜上的周细胞共同组成了iBRB的基本框架,周细胞包裹着REC，提供结构和信号支持[36]，视网膜内皮功能障碍可能是周细胞的丢失与REC脱失导致脱细胞毛细血管形成的共同结果。尽管本综述主要探讨REC的功能障碍，但REC与周细胞、Müller细胞、神经元和小胶质细胞共同组成了RVUT，细胞间的相互作用对正常的REC功能至关重要，细胞间的信号转导和失调导致视网膜血管疾病的发展。在体内，糖尿病相关的REC损伤可能主要是由于葡萄糖诱导邻近细胞的细胞因子释放，而不是高糖对REC本身的直接影响。小胶质细胞激活后分泌炎症因子，神经元细胞死亡后分泌的炎症因子和ATP都可以导致REC的炎症反应及凋亡。用人脂肪组织来源的基质细胞在小鼠中作为功能周细胞，可以抑制高糖诱导的牛REC的促炎激活[37]。REC之间以及与其他细胞间的信号串扰是很有意义的研究方向，能够为治疗DR提供新的思路。