黄芩苷调节IL-33/ST2信号通路对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜新生血管生成的影响△

帅天姣 王彤彤 谢 伟 帅 印 朴天华 庄天微

糖尿病视网膜病变(DR)属于糖尿病常见微血管并发症。糖尿病患者由于糖代谢障碍，体内长期的高血糖状态损害血-视网膜屏障，引起视网膜微血管异常增生，影响视网膜功能，导致患者视力减退甚至失明，严重危害患者的身心健康[1-2]。近年来，糖尿病患病人数急剧增加，DR的发病人数亦随之增加，带来的种种不便受到人们的重视[3]。DR的发病机制非常复杂，目前尚无确切结论，但过度的炎症反应是DR的重要发病机制[4]。白细胞介素(IL)-33/基质裂解素2(ST2)信号通路在糖尿病等多种疾病中介导炎症反应，参与糖尿病心血管病变过程[5-6]。目前，DR临床治疗以羟苯磺酸钙等西药为主，能够明显改善视网膜微循环，但存在毒副作用、后期效果不明显等缺点，因而探索中药制剂防治DR具有重要的临床价值[7]。黄芩苷是中药黄芩中的一种黄酮类有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗过敏及抑凋亡等功效，对糖尿病并发症的靶器官具有保护作用[8-9]。有研究发现，黄芩苷能抑制视网膜神经节细胞凋亡，治疗DR[10]。但黄芩苷对DR中视网膜新生血管生成情况的影响尚未见报道。本研究将探讨黄芩苷调节IL-33/ST2通路对DR大鼠视网膜新生血管生成的影响，以期为改善DR症状提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康无眼部疾病的SD大鼠50只，体重210～230(221.58±6.35)g，购自广州赛业百沐生物科技有限公司，许可证号为SCXK(粤)2020-0055。饲养条件：室内湿度40%～50%，温度23～25 ℃，明暗周期12 h/12 h，定期紫外线照射消毒。大鼠自由进食，自由进水，自由活动。本研究实验动物的使用均符合《实验动物管理条例》。

1.1.2 主要试剂与仪器链脲佐菌素(货号：K0050)、黄芩苷(货号：D0637)均购自上海宝曼生物科技有限公司；大鼠血管内皮生长因子(VEGF)(货号：SEKR-0032)、IL-6(货号：SEKR-0005)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(货号：SEKR-0009)ELISA试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠Ang-1(货号：xy-E12734)、IL-33(货号：xy-A13820)ELISA试剂盒均购自上海信裕生物科技有限公司；兔抗IL-33(货号：ab187060)、兔抗ST2(货号：ab228543)、兔抗GAPDH(货号：ab9485)、羊抗兔二抗(货号：ab97051)均购自英国Abcam。MODEL550酶标仪购自美国Bio-Rad公司；MG8000化学发光成像系统购自美国Thmorgan公司。

1.2 方法

1.2.1 DR大鼠模型制备参照文献[11]制备DR大鼠模型。大鼠适应性喂养1周后，腹腔注射70 mg·kg-1链脲佐菌素溶液，3 d后断尾测量血糖，当血糖≥16.7 mmol·L-1时为糖尿病模型建立成功。糖尿病大鼠给予高糖高脂饲料喂养，16周后观察大鼠眼底，有明显视网膜出血、毛细血管扩张、动静脉异常者视为DR模型制备成功，未制备成功的大鼠予以剔除，并及时补充。所有大鼠均以右眼为实验眼。

1.2.2 实验分组及实验给药将40只造模成功的DR大鼠分为DR模型组和黄芩苷低、中、高剂量组，每组10只。另取同期一直用基础饲料喂养的10只正常大鼠作为对照组。DR模型组和对照组大鼠灌胃生理盐水；黄芩苷低、中、高剂量组大鼠分别给予75 mg·kg-1、150 mg·kg-1、300 mg·kg-1黄芩苷灌胃[10]，均为每天1次，灌胃6周结束。

1.2.3 FFA检查大鼠视网膜血管生成情况灌胃结束后次日，每组各取4只大鼠，右眼滴复方托吡卡胺滴眼液，待充分散瞳后，给予1 mL·kg-1的100 g ·L-1的荧光素钠溶液腹腔注射，观察大鼠右眼荧光素渗漏情况及新生血管生成情况。

1.2.4 ELISA检测大鼠血清血管生成相关因子及炎症因子水平每组剩余6只大鼠用100 g ·L-1水合氯醛麻醉，腹主动脉取血3 mL，冰上静置2 h后，3000 r·min-1离心5 min，分离血清于无菌Eppendorf管内。血清样本分别用VEGF、Ang-1、IL-6、IL-33、TNF-α ELISA试剂盒进行ELISA检测，酶标仪测定吸光度(D)，根据标准品的D绘制标准曲线，计算大鼠血清VEGF、Ang-1、IL-6、IL-33、TNF-α水平。

1.2.5 Western blot检测大鼠视网膜组织中IL-33/ST2信号通路相关蛋白表达情况大鼠取血后，颈椎脱臼法处死，完整摘下右眼眼球，剪除角膜，除去虹膜、晶状体及玻璃体，将视网膜组织匀浆，加入组织裂解液抽提总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取20 μg总蛋白与适量上样缓冲液混匀，100 ℃沸水浴变性，120 g ·L-1SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并转移至PVDF膜上，50 g ·L-1脱脂奶粉室温封闭1 h，不同的目的蛋白条带放入对应的一抗稀释液(兔抗IL-33、兔抗ST2、兔抗GAPDH，均12000稀释)中，4 ℃过夜，用二抗稀释液(11500稀释)37 ℃ 孵育1 h，化学发光法显色显影，ImageJ软件分析条带灰度。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜血管生成情况对照组大鼠右眼视网膜血管分布均匀，荧光素无渗漏。DR模型组大鼠右眼眼底新生血管增多，荧光素渗漏明显。相对于DR模型组，黄芩苷低、中、高剂量组大鼠右眼视网膜新生血管有不同程度减少，荧光素渗漏亦有减少，且黄芩苷高剂量组新生血管、荧光素渗漏面积减少更明显(图1)。

图1 FFA检查各组大鼠右眼视网膜血管生成情况 A：对照组;B：DR模型组;C：黄芩苷低剂量组;D：黄芩苷中剂量组;E：黄芩苷高剂量。

2.2 各组大鼠血清血管生成相关因子水平ELISA检测结果显示，与对照组相比，DR模型组大鼠血清VEGF、Ang-1水平均显著升高(均为P<0.05)。与DR模型组相比，黄芩苷低、中、高剂量组大鼠血清VEGF、Ang-1水平均显著降低(均为P<0.05)。随着黄芩苷剂量的升高，大鼠血清VEGF、Ang-1水平均逐渐降低(均为P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血清VEGF、Ang-1水平

2.3 各组大鼠血清炎症因子水平ELISA检测结果显示，与对照组相比，DR模型组大鼠血清IL-6、IL-33、TNF-α水平均显著升高(均为P<0.05)。与DR模型组相比，黄芩苷低、中、高剂量组大鼠血清IL-6、IL-33、TNF-α水平均显著降低(均为P<0.05)。随着黄芩苷剂量的升高，大鼠血清IL-6、IL-33、TNF-α水平均逐渐降低(均为P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠血清IL-6、IL-33、TNF-α水平

2.4 各组大鼠视网膜组织中IL-33/ST2信号通路相关蛋白表达情况Western blot检测结果见图2和表3。与对照组相比，DR模型组大鼠视网膜组织中IL-33、ST2蛋白相对表达量均显著升高(均为P<0.05)。与DR模型组相比，黄芩苷低、中、高剂量组大鼠视网膜组织中IL-33、ST2蛋白相对表达量均显著降低(均为P<0.05)。随着黄芩苷剂量的升高，大鼠视网膜组织中IL-33、ST2蛋白相对表达量均逐渐降低(均为P<0.05)。

图2 各组大鼠视网膜组织中IL-33、ST2蛋白表达情况 A：对照组;B：DR模型组;C：黄芩苷低剂量组;D：黄芩苷中剂量组;E：黄芩苷高剂量。

3 讨论

糖尿病发病率近年来呈现逐年增高趋势，对人类健康威胁仅次于心血管疾病和肿瘤，其对人类健康的威胁主要在于会导致全身各器官的微血管发生病理性改变[12]。DR是视网膜微血管发生病理性改变的糖尿病并发症，视网膜新生血管形成是其病情发展最重要的一环，而由于高血糖状态下的视网膜新生血管发育并不完全，容易出血或机化，可牵拉视网膜产生裂孔或脱离，导致患者视力下降或丧失，是糖尿病患者视力丧失的主要原因之一[11,13-14]。因此，探讨DR患者视网膜新生血管生成的机制，并寻求能安全有效地抑制新生血管生成的治疗措施已成为DR研究的重要课题之一。

黄芩苷是传统中药黄芩的有效成分之一，是一种黄酮类化合物，因其具有抗炎、抗氧化、抗高血压、抗动脉粥样硬化等多种药理活性，可对生物机体发挥保护作用[15]。郭斌等[16]研究表明，黄芩苷能通过抑制肺部的炎症反应，从而降低急性肺损伤大鼠肺组织的损伤程度。吴军等[17]研究显示，黄芩苷可以缓解高血糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡，可能达到治疗糖尿病肾病小鼠的作用。刘珣等[10]研究发现，黄芩苷可能是通过抑制视网膜神经节细胞凋亡对DR大鼠起治疗作用。朱勤伟等[15]研究显示，黄芩苷能降低血糖、血脂，改善铁代谢紊乱，保护糖尿病大鼠血管免受损伤。本研究结果显示，大鼠建立DR模型后，眼底新生血管增多，且能观察到荧光素明显渗漏，血清血管生成相关因子VEGF、Ang-1及炎症因子IL-6、IL-33、TNF-α水平均显著升高，表明本研究建立的DR大鼠模型已有视网膜新生血管形成及血管出血现象，且体循环中已有大量血管生成相关因子、炎症因子生成。使用黄芩苷治疗后，大鼠视网膜新生血管生成减少，荧光素渗漏减少，血清VEGF、Ang-1、IL-6、IL-33、TNF-α水平均降低，且随着黄芩苷使用剂量的升高，对DR大鼠的影响逐渐加深，本研究结果与勤伟等[15]和郭斌等[16]研究结果一致，表明黄芩苷能减轻DR大鼠体内炎症水平及血管生成因子的生成，减少视网膜新生血管生成及出血。

IL-33属于IL-1家族成员，在炎症反应、免疫应答调节中起着核心作用。而ST2属于IL-1受体家族成员，是IL-33的主要受体，两者结合可促进促炎细胞因子的产生、释放[18]。有研究显示，IL-33/ST2信号通路能通过影响肿瘤干性、肿瘤生长和转移、血管生成等过程，在肿瘤发生中发挥关键作用[19-20]。Theodoropoulou等[21]研究显示，IL-33及其受体ST2在人、鼠视网膜中表达，能调节组织重塑及眼部血管生成。Miller等[22]研究发现，IL-33能使炎症、血管生成和病变增殖持续存在，进而调节子宫内膜异位症病变存活及进展。本研究结果显示，DR模型组大鼠视网膜组织中IL-33、ST2蛋白表达水平均较对照组显著升高，血清IL-33水平亦较对照组显著升高，提示IL-33/ST2信号通路参与DR发病，并推测IL-33/ST2信号通路可能参与调控DR大鼠体内炎症、新生血管生成过程。本研究结果与文献对IL-33/ST2信号通路在炎症、血管生成方面的研究一致[21-22]。进一步使用黄芩苷治疗后，DR大鼠视网膜组织中IL-33、ST2蛋白表达水平均显著降低，且随着黄芩苷使用剂量的升高而逐渐降低，表明黄芩苷可抑制IL-33/ST2信号通路激活，减轻DR大鼠体内炎症水平，减少视网膜新生血管生成。

综上所述，黄芩苷可抑制DR大鼠视网膜组织中IL-33/ST2信号通路激活，减轻体内炎症水平，减少视网膜新生血管生成，为临床利用传统中药改善DR症状提供参考，但黄芩苷是否亦通过其他通路发挥作用仍有待后续深入分析。