分泌粒蛋白III (Scg3)抗体对角膜新生血管的抑制作用△

靳 荷 杨彬彬 蒋冬冬 郑 柳 丁芝祥 陆素青

角膜新生血管(CNV)是引起角膜盲的主要疾病之一[1]。我们在早期研究中发现，CNV也是引起角膜移植排斥反应导致移植失败的主要影响因素[2-5]。2017年，LeBlanc等[6]研究发现，分泌粒蛋白III(Scg3)和血管内皮生长因子(VEGF)作用相似，都能够影响糖尿病视网膜病变动物模型中眼底新生血管的生长，成为一种新近发现的新生血管影响因子，但对其的研究仍仅局限在眼底新生血管，尚未见其对CNV的生长调控进行探索的研究。因此，本研究通过碱烧伤法建立兔CNV模型，应用Scg3抗体进行干预治疗，观察CNV的面积和长度变化，应用角膜共聚焦显微镜、蛋白芯片法观察Scg3抗体对眼表的影响，评估Scg3抗体是否能够有效抑制CNV的形成，为CNV的治疗提供新的思路以及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物健康的成年新西兰白兔45只，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，体重1.7～2.0 kg，雌雄不限。所有动物实验操作均符合《实验动物管理条例》，并获得桂林医学院动物伦理委员会的批准(批准号：2019-0005)，给予人道主义关怀。

1.1.2 主要试剂Scg3多克隆抗体(美国LifeSpan公司)，盐酸丙美卡因滴眼液(美国Alcon公司)，盐酸赛拉嗪注射液(长春军需大学兽医研究所)，戊巴比妥钠(上海沃凯国药集团化学试剂公司)，GAPDH抗体(美国Abcam公司)，二抗(美国Affinity Biosciences公司)。蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，蛋白芯片检测试剂盒(美国RayBiotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型及分组处理统一选取兔右眼进行实验。盐酸赛拉嗪注射液0.2 mL·kg-1肌肉注射配合戊巴比妥钠30 mg·kg-1耳缘静脉注射进行全身复合麻醉，麻醉完全后，再用盐酸丙美卡因滴眼液进行眼表面麻醉。将直径8 mm的圆形滤纸片浸泡于1.0 mol·L-1的氢氧化钠溶液中10 s，充分浸泡后，用无菌棉签吸除滤纸片表面多余的氢氧化钠，将滤纸片置于兔右眼角膜中央40 s后取下，立即用生理盐水充分冲洗右眼结膜囊及角膜碱烧伤部位，冲洗持续约2 min。碱烧伤后予以左氧氟沙星滴眼液滴眼预防感染。

未做碱烧伤的5只健康新西兰白兔为对照组，剩余40只兔在进行碱烧伤后随机分为干预组和模型组2组(每组20只)，干预组兔在右眼颞上方结膜下注射0.1 mL浓度为 0.5 mg·L-1的Scg3抗体工作液，模型组兔注射0.1 mL 1×PBS溶液，均自碱烧伤之日起每隔2 d结膜下注射1次，观察周期为14 d。

1.2.2 CNV生长情况于兔眼角膜碱烧伤后的1 d、7 d、14 d，使用裂隙灯显微镜摄像系统拍摄兔眼角膜照片。用角膜共聚焦显微镜观察CNV及其血流情况。采用图像分析软件(ImageJ)对图片进行分析，测量兔眼CNV的长度(以血管朝向角膜中央生长的最长血管计算)，并测量CNV所占的钟点数。按照Rodert公式[7]，即S=C/12×3.14×[r2-(r-l)2]计算新生血管的面积，其中S为CNV面积，C为CNV所占的钟点数，r为角膜半径(按兔的平均角膜半径7 mm计算)，l为CNV的长度。

1.2.3 蛋白芯片法检测眼前段炎症因子于兔眼角膜碱烧伤后1 d、7 d、14 d，从模型组与干预组兔眼睑缘边缘和结膜囊内收集眼表泪液，-20 ℃保存。用蛋白芯片检测试剂盒，通过GenePix 4000B 微针列芯片扫描技术检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等炎症相关细胞因子的表达。

1.2.4 Western blot检测Scg3蛋白表达于兔眼角膜碱烧伤后 14 d，取对照组和模型组兔各5只使用过量盐酸赛拉嗪注射液安乐死后，均取右眼角膜，液氮研磨，蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，于100 g·L-1聚丙烯酰胺凝胶中电泳。用湿转电转膜法将蛋白转移到PVDF膜上，摇床封闭1.5 h后，分别加入Scg3抗体(11000)、GAPDH抗体(13000)，4 ℃过夜，加入二抗(13000)室温下摇床孵育1 h，使用ECL检测，以GAPDH为内参，用ImageJ软件进行相对灰度值定量分析。

2 结果

2.1 临床观察CNV对照组兔角膜未进行碱烧伤，观察期内角膜正常，无CNV生长。模型组兔角膜碱烧伤后1 d，可见碱烧伤区域角膜上皮缺损，角膜缘血管扩张，角膜出现明显炎症反应；碱烧伤后7 d，角膜缘出现CNV向角膜内生长；碱烧伤后14 d，可见大量CNV生长。干预组兔角膜碱烧伤后1 d，可见碱烧伤区域角膜上皮缺损，角膜缘血管扩张，角膜出现明显炎症反应；但在碱烧伤后7 d和14 d，均无明显CNV生长，烧伤直径较模型组明显缩小，同时，干预组兔的眼前段反应较模型组轻(图1)。角膜共聚焦显微镜观察可见，碱烧伤后14 d，模型组兔的角膜缘内出现大量活动性CNV(图2)。

图1 碱烧伤后不同时间点模型组和干预组兔眼CNV的生长情况(各取2眼典型图像)

图2 角膜共聚焦显微镜观察模型组兔角膜碱烧伤后14 d的CNV(箭头示CNV)

2.2 CNV的长度和面积角膜碱烧伤后7 d和14 d，干预组中兔眼CNV长度均显著低于模型组，CNV面积也均较模型组小，差异均有统计学意义(均为P<0.001)(表1)。

表1 模型组和干预组兔角膜碱烧伤后不同时间点CNV长度和面积

2.3 Western blot检测Western blot检测结果显示，与对照组相比，碱烧伤后14 d模型组兔角膜中Scg3蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

2.4 蛋白芯片法检测结果模型组和干预组兔眼表泪液中ICAM-1、IL-10、TGF-β1的表达在碱烧伤后1 d 即迅速增高，碱烧伤后7 d有所降低，碱烧伤后 14 d 进一步降低。碱烧伤后7 d、14 d，与模型组相比，干预组兔眼表泪液中ICAM-1、IL-10、TGF-β1的表达均显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图4)。

图4 蛋白芯片法检测模型组与干预组兔眼表泪液中碱烧伤后不同时间各炎症因子表达

3 讨论

角膜病是主要的致盲性眼病，世界上有超过1000万的双眼角膜盲患者，每年新增角膜盲病例高达150万～200万[8]。其中， CNV是引起角膜盲的重要疾病之一[1]。CNV是由于眼部酸碱烧伤、眼外伤、角膜炎、长期不正确配戴角膜接触镜或者高危角膜移植等刺激，导致角膜缘新生血管向透明的角膜区生长形成，进而引起角膜水肿、角膜混浊[1]。明显的角膜混浊和相应角膜表面不规则散光导致的屈光力改变是引起视力下降的主要原因[9-10]。目前多种治疗CNV的方案，虽然能够在一定程度上抑制CNV的生长[11-13]，但是也存在一些副作用，如导致角膜基质变薄、眼压升高、炎症反应加重等[14-16]。

大量研究表明，除VEGF外，其他的血管生长因子也参与诱导CNV的形成[17]。有研究发现，Scg3和VEGF作用相似，也在新生血管生长中起作用，是一种新近发现的新生血管影响因子[6，18]。LeBlanc等[6]研究发现，Scg3仅存在于病理性的新生血管中，即眼底新生血管和CNV中。我们也同样在蛋白水平上发现兔角膜CNV组织中有Scg3的表达。同时，LeBlanc等[6]在研究中发现，抑制Scg3的表达可以有效地选择性抑制眼底病理性新生血管的生长，而对正常毛细血管的功能无明显影响。但其研究仅局限在Scg3对眼底新生血管的作用，并未探索抑制Scg3的表达对CNV的生长调控作用。CNV形成机制与糖尿病视网膜病变中新生血管形成机制并不完全相同。CNV形成机制主要为促新生血管生成与抗新生血管生成系统的失衡导致[19]；而糖尿病视网膜病变新生血管形成主要是由于糖尿病所导致的高血糖、低氧微环境，激活许多下游靶基因导致，包括激活炎症细胞因子和血管活性肽因子等[20]。但是，炎症细胞因子在CNV和糖尿病视网膜病变新生血管的形成中均起到重要作用[21]。我们在前期研究中也发现，炎症反应相关的细胞因子能够刺激新生血管相关因子活化，进而刺激新生血管的形成[3]。同时，我们也在兔眼的CNV模型中发现有Scg3的表达。所以，我们推测抗Scg3能够在一定程度上抑制CNV的生长，同时减轻眼表的炎症反应。

我们通过查阅文献，在预实验中应用0.5 mol·L-1、1.0 mol·L-1、2.0 mol·L-1、4.0 mol·L-1等多种氢氧化钠溶液浓度和烧伤30 s、40 s、50 s等多个时间点建立兔角膜碱烧伤模型，发现当浓度过大或烧伤时间过长时均容易引起角膜溶解，我们最后选定1.0 mol·L-1的氢氧化钠溶液烧伤40 s建立兔角膜碱烧伤模型。然后，根据LeBlanc等[6]的体内研究得出的Scg3抗体治疗眼底新生血管性疾病的浓度及细胞实验中使用的Scg3抗体浓度，我们在预实验中进一步探索了结膜下注射Scg3抗体治疗CNV的最佳浓度，结果显示，Scg3抗体浓度过高时(0.8 mg·L-1或1.0 mg·L-1)会刺激CNV的生长，而Scg3抗体浓度过低时(0.1 mg·L-1或0.3 mg·L-1)则不能抑制CNV的生长，因而我们最终选定0.5 mg·L-1Scg3抗体浓度进行实验。同时考虑到结膜下注射方式对CNV生长的诱导刺激，我们实验了不同给药方式，结果显示，将不同浓度的Scg3抗体用滴眼的方式治疗CNV，或减少结膜下注射的次数，均不能有效抑制CNV的生长。因而，造模成功后采用每2 d结膜下注射Scg3抗体的给药方式，将Scg3抗体应用于CNV治疗，进而评估Scg3抗体对CNV的影响。

Edelman等[22]将CNV的形成分为血管生长前的非增殖期和血管生长速度最快的增殖期、血管密度降低的回归期三个阶段。这与本研究中CNV的生长趋势相一致。碱烧伤后1 d，由于角膜受到碱烧伤的刺激，可见模型组兔碱烧伤区域角膜上皮缺损，角膜缘血管扩张，无CNV长入角膜，为新生血管生长前的非增殖期；碱烧伤后7 d，CNV的生长水平达到高峰，进入增殖期；碱烧伤后14 d，CNV的生长水平进一步变缓，CNV的长度及面积达到最高值，此时处于回归期。这也与碱烧伤后的炎症反应有关，IL-10是免疫调节和炎症反应中的重要因子[23]，也能够激活TGF-β的表达[24]。TGF-β1、ICAM-1均是炎症反应中的重要细胞因子[25-26]。所以，我们通过蛋白芯片法检测碱烧伤后1 d、7 d和14 d兔眼表泪液中的IL-10、TGF-β1和ICAM-1的表达，结果显示，碱烧伤后1 d，3个炎症因子的表达均明显升高，碱烧伤 7 d 和14 d均有所降低。角膜碱烧伤后角膜上皮及角膜缘干细胞损伤，在初始阶段，炎症反应使大量的炎症细胞被吸引至损伤部位，角膜上皮释放大量的炎症因子和血管生长因子，破坏血管生长因子与抗血管生长因子间的平衡，刺激新生血管及淋巴管生成；碱烧伤后14 d，炎症因子的表达逐渐减少，炎症反应降低，所以不再出现新的CNV生长，此时CNV的生长也达到了高峰。在干预组中，Scg3抗体应用之后，CNV的长度和面积均低于模型组，炎症因子的表达在碱烧伤后7 d也明显低于模型组，眼前段的炎症反应明显降低，CNV的生长被明显抑制。碱烧伤后14 d，模型组和干预组兔眼表泪液中的炎症因子表达均进一步下降，CNV生长已经趋于稳定，干预组兔眼中的CNV长度及面积均明显低于模型组。因此，在兔角膜碱烧伤后，应用Scg3抗体干预，能够减轻炎症反应，CNV的生长也被明显抑制。

综上，我们发现Scg3抗体在一定程度上可以有效抑制角膜碱烧伤诱导的CNV的生成，其可能与Scg3抗体可以抑制角膜碱烧伤后的炎症反应，从而抑制CNV的生成有关。我们将进一步对Scg3参与CNV及淋巴管形成的机制进行体内研究，为CNV的治疗或联合治疗提供新的方案。