宫颈癌组织中HPV16 E6、E7蛋白水平与患者临床病理特征及预后的关系

路 玲，张媛媛，徐 瑶，吴宝华，徐 蕾，吴海燕

(1.成都医学院第一附属医院妇科，四川 成都 610500；2.新疆医科大学附属肿瘤医院妇科，新疆 乌鲁木齐 830054)

宫颈癌是全球女性最常见的生殖系统恶性肿瘤，据统计2018年全球宫颈癌新发病例超过56万人，由于宫颈癌导致的死亡病例超过31万人[1]。宫颈癌是我国女性发病率第二高的恶性肿瘤，早期宫颈癌由于症状和体征不明显易被忽略，导致疾病的进展和蔓延，晚期宫颈癌患者预后通常较差，五年生存率低于40%，严重威胁我国女性健康安全[2]。过去的研究已证实宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染密切相关，目前HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35等15种高危型HPV已被报道参与宫颈癌的发生和进展[3]，其中又以HPV16、HPV18感染率最高，占所有高危型HPV感染的70%以上[4]。16型人乳头瘤病毒E6蛋白(human papilloma virus type 16 E6 protein，HPV16 E6)和16型人乳头瘤病毒E7蛋白(human papilloma virus type 16 E7 protein，HPV16 E7)均是HPV16基因编码的蛋白质，相关研究表明其参与宫颈癌[5]、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[6]的发生和进展，但宫颈癌中HPV16 E6、HPV16 E7水平与患者临床病理特征和预后的关系尚不完全明确，本研究通过免疫组织化学法检测宫颈癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达情况，旨在为宫颈癌患者的治疗及预后评估提供相关依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年3月—2018年3月于成都医学院第一附属医院行宫颈癌根治术的宫颈癌患者87例，年龄25～73岁，平均(50.11±10.14)岁；采用国际妇产科联盟(International Federation of Obstetrics and Gynecology，FIGO)标准进行分期，其中ⅠA期～ⅠB1期56例，ⅠB2期～ⅡA期31例；中、高分化60例，低分化27例。留取每例患者术中切除的肿瘤组织、癌旁组织(距肿瘤组织>2 cm)、正常宫颈组织标本，每种组织标本为一组。本研究中选取的左右组织均为宫颈癌根治术中收集到的肿瘤组织、癌旁组织以及正常组织，组织新鲜，经甲醛固定后采用石蜡包埋保存。纳入标准：①患者均初发宫颈癌，诊断标准依据《宫颈癌诊疗规范(2018年版)》[7]；②患者身体状况良好，能够接受手术治疗；③患者术前未接受放、化疗、靶向治疗及生物免疫治疗；④患者未合并其他恶性肿瘤、自身免疫性疾病、精神神经疾病。排除标准：①患者为宫颈癌复发或其他脏器肿瘤转移；②患者合并心脏、肾脏等重要脏器功能不全；③患者术前接受过放、化疗、靶向治疗及生物免疫治疗。采用电话、微信、电子邮件、门诊等方式对患者进行随访，随访间隔为3个月，随访患者死亡则停止随访，随访时间截止至2021年3月。本研究经医院伦理委员会审核并通过，所有患者及家属均知情同意且签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1试剂与耗材 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白兔抗人一抗均购自美国SCBT公司；SP免疫组织化学法试剂盒、DAB-Kit显色液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer salin，PBS)、苏木精染液、中性树胶均购自北京中杉金桥生物遇险公司；高性能组织病理切片、光学显微镜均购自德国徕卡公司。

1.2.2免疫组织化学法检测HPV16 E6、HPV16 E7表达水平 将病理组织切片采用二甲苯脱蜡处理，梯度乙醇水化后滴加3%过氧化氢溶液封闭15 min消除内源酶，加入柠檬酸型抗原修复液(pH=6.0±0.1)，采用高压抗原修复法修复抗原，冷却后使用PBS冲洗，滴加山羊血清封闭内源性生物素。HPV16 E6、HPV16 E7一抗均按照说明书所示进行1∶100稀释，与切片在4 ℃湿盒中孵育过夜，次日PBS冲洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育1 h，PBS冲洗后滴加DAB-Kit显色30 s左右，水洗终止显色，再滴加苏木精复染1 min，梯度酒精脱水后中性树胶封片，显微镜下观察并对染色结果进行评分。

1.2.3结果判读 显微镜下观察HPV16 E6、HPV16 E7蛋白均表达于细胞核和细胞浆中，但主要在细胞核中表达。以镜下出现棕黄色颗粒为蛋白阳性表达，高倍镜下随机取5个视野并计数1 000个细胞，根据阳性细胞所占比例进行评分。根据染色强度评分：未着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、褐色为3分；根据阳性细胞所占比例进行评分：<10%为0分、10%～40%为1分、40%～70%为2分，>70%为3分。以上述两项得分相乘，<2分为蛋白阴性表达，2～3分为(+)，4～7分为(++)，≥8分为(+++)，已评分≥2分为蛋白阳性表达。

1.3统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，采用Kaplan-Meier生存曲线比较患者生存情况，采用COX回归分析各项因素对患者预后的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达情况 癌旁组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性率高于正常组织，肿瘤组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性率高于癌旁组织和正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同组织中HPV16 E6、E7蛋白阳性率比较

2.2HPV16 E6、HPV16 E7蛋白与临床病理特征的关系 3中组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达在不同的患者年龄、肿瘤组织学类型中差异无统计学意义(P>0.05)，但在肿瘤FIGO分期、分化程度、合并淋巴结转移情况、肌层浸润深度以及肿瘤直径中差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，3。

表2 HPV16 E6蛋白与临床病理特征的关系

表3 HPV16 E7蛋白与临床病理特征的关系

2.3HPV16 E6、HPV16 E7与患者生存率的关系 截至2021年3月，宫颈癌患者87例中存活60例，死亡25例，失访2例，患者3年生存率68.97%，所有死亡患者均死于宫颈癌复发或进展。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示前宫颈癌组织HPV16 E6及HPV16 E7蛋白阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 HPV16 E6、HPV16 E7表达与患者生存率的关系

2.4HPV16 E6、HPV16 E7与患者预后的关系 以患者预后(预后良好=0，预后不良=1)为自变量，以HPV16 E6(阴性=0，阳性=1)、HPV16 E7(阴性=0，阳性=1)、年龄(<50岁=0，>50岁=1)、FIGO分期(ⅠA～ⅠB1=0，IB2～ⅡA=1)、组织学分型(腺癌=0，鳞癌=1)、分化程度(低分化/中=0，高分化=1)、淋巴结转移(未合并=0，合并=1)、肌层浸润深度(<1/2=0，≥1/2=1)、肿瘤直径(≤4 cm=0，>4 cm=1)，多因素分析显示，HPV16 E6阳性、HPV16 E7阳性、FIGO分期(IB2～ⅡA)、肌层浸润深度(≥1/2)、肿瘤直径(>4 cm)均可作为宫颈癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 HPV16 E6、HPV16 E7与患者预后的多因素回归分析

3 讨 论

研究表明，宫颈癌的发生发展与HPV感染具有密切联系，在宫颈癌组织中检出率极高，持续HPV感染能够引起宫颈不典型增生，是宫颈癌的常见诱因之一[8]。随着医学研究的进步，到目前为止人类已分离并鉴定了超过150种HPV基因型，并根据其致癌能力的差异将HPV分为主要引起良性病变的低危型HPV(如HPV6型、11型)和能够引起细胞恶性转化的高危型HPV(如HPV16型、18型)[9]。HPV是一种小型环状DNA病毒，主要感染皮肤以及生殖器，但相关文献报道HPV与口腔鳞癌、乳腺癌等恶性肿瘤的发生相关，但结果尚不完全明确[10-11]。

病毒蛋白HPV16 E6、E7与HPV的致癌性密切相关，研究显示E6、E7蛋白不具备酶的活性，通过与宿主细胞内蛋白形成复合物的形式参与细胞生命活动的调控[11]。E6蛋白能够与细胞内泛素连接酶结合并改变构象，特异性结合细胞内p53蛋白，导致p53泛素化并降解[12-13]，p53是目前已知具有最强的抑癌基因，E6通过降解p53表达产物抑制抑癌基因活性，从而参与肿瘤的发生和发展，具有较强的促肿瘤作用。而E7蛋白能够与抑癌基因pRb产物特异性结合并导致其失活，导致细胞周期失控，抑制细胞凋亡过程，引起细胞过度增殖，诱导肿瘤疾病的产生[14]。相关研究表明HPV感染后E6、E7共同发挥作用，E7蛋白促进肿瘤的生长，而E6蛋白大大提高E7的致癌能力，仅E7蛋白异常表达常导致尖锐湿疣等良性病变的发生，而联合E6蛋白异常表达则常导致恶性病变而发生。

本研究显示宫颈癌组织中HPV16 E6、E7蛋白阳性率明显高于癌旁组织和正常组织，且与肿瘤FIGO分期、分化程度、合并淋巴结转移情况、肌层浸润深度以及肿瘤直径相关，提示宫颈癌组织中HPV16 E6、E7蛋白存在过表达情况，且促进肿瘤的生长和进展。李芳等[15]研究显示HPV16 E6、E7 DNA水平升高对宫颈癌淋巴结转移具有预警作用，可作为反映宫颈癌淋巴结微转移的指标；王慧玲等[16]研究显示抑制宫颈癌细胞中HPV16 E6、E7蛋白的表达能够抑制宫颈癌细胞的上皮间质转化过程，促进肿瘤细胞的凋亡。上述结果均反映HPV16 E6、E7蛋白过表达促进了宫颈癌的发生和发展。本研究结果显示HPV16 E6、E7蛋白阳性的宫颈癌患者3年生存率低于阴性患者，单因素回归分析结果显示HPV16 E6、E7蛋白阳性表达均能够给增加患者死亡风险，而多因素回归分析结果显示HPV16 E6、E7蛋白阳性表达均与患者预后不良相关，可作为患者预后的独立预测指标发挥临床作用。

综上所述，宫颈癌患者肿瘤组织中HPV16 E6、E7蛋白呈高表达，且与患者临床病理特征和预后相关，可作为患者预后的独立预测指标，可能为宫颈癌诊断和治疗的提供相关靶点，本研究的不足之处在于研究样本量较少，且能够对HPV16 E6、E7蛋白促进宫颈癌发生发展的机制进行研究，需要在后续研究中加以补足。