早期肠内营养对胆道闭锁幼鼠的肠道黏膜结构及微生态保护作用的研究

吴宙光，王 斌，左桃燕，陈思琦，付静茹，张文杰

(广东省深圳市儿童医院普外科，广东 深圳 518026)

胆道闭锁(biliary astresia，BA)以肝内外胆管进行性炎症和胆汁淤积性黄疸为特点，可导致婴幼儿出现进行性肝纤维化和肝硬化，甚至出现肝衰竭。肝门-空肠吻合术(kasai portoenterostomy, kasai)是治疗BA的主要手术方式，研究表明，BA患儿kasai术后易出现肝功能损伤、胆管炎、持续性黄疸等并发症，其中胆管炎是BA患儿kasai术后最为常见的并发症，多于术后1年内发生[1]，术后胆管炎的发生多与术后食物反流、胆道梗阻、肠道微生物迁移、肠道黏膜功能紊乱和免疫功能、患儿营养状态等因素密切相关[2]。因此，寻找减少kasai术后并发症发生的有效治疗方法显得尤为重要。营养支持治疗对BA患儿kasai术后具有重要作用，分为肠外营养(parenteral nutrition,PN)和肠内营养(enteral nutrition,EN)。EN具有价格更为低廉、符合生理需求等优势，在保护肠道黏膜、调节免疫功能等方面更优于PN，主要通过改善肠道黏膜稳定性和调节肠道菌群等发挥重要作用[3-5]。目前尚无充分基础实验数据支持EN治疗对BA改善患儿肠黏膜结构及微生态保护方面的作用。本研究拟探讨EN治疗对BA幼鼠肠道黏膜结构改善及微生态保护等方面的作用，为今后开展临床营养治疗BA患儿提供充分的理论基础。

1 材料与方法

1.1BA幼鼠模型构建 雄性Wistar大鼠(3～4周)80～100 g，术前禁食12 h，禁水4 h，氯胺酮20 mg/kg腹腔注射麻醉，取上腹正中切口，显露肝十二指肠韧带，于近肝门处游离并结扎胆总管。假手术组仅做游离但不结扎胆总管。模型制作成功标准：术后3 d采静脉血检查血总胆红素和直接胆红素，超出正常值5倍为造模成功。将幼鼠置于22～26 ℃，相对湿度40%～70%，通风、安静的环境中分笼喂养。PN模型：幼鼠取右颈外侧2 cm长切口，游离颈外静脉，用20针头于颈前切口作一通向肩胛区的隧道，将静脉导管20号针头自背部引至颈前部，1号线结扎颈外静脉远心端，近心端剪一V字形切口将导管向心脏方向插入1.0～1.5 cm，避免过深而进入右心房，抽吸回血后，结扎固定导管，缝合切口，把从肩胛区引出的静脉导管顺序穿过背扣、保护弹簧及旋转装置，与限速输液泵连接。若造模和治疗过程中，幼鼠出现死亡再次利用新的BA幼鼠模型补充，进行后续治疗。

本研究通过医院动物伦理委员会批准。

1.2分组及治疗方案 将40只BA幼鼠采用随机法分为假手术组、PN组、EN组、抗生素组，每组10只，所有幼鼠手术后12 h均予以常规自由水治疗，假手术组和抗生素组用普通饲料打成匀浆后灌胃治疗，抗生素组予以氨苄青霉素治疗(1 g/L，溶于普通饲料中，美国sigma公司)，PN组和EN组分别予以PN和EN治疗。PN营养制剂(辽宁海思科制药有限公司)，100%由静脉营养液提供热、氮量，微量泵输注，3.3 mL/h，EN组予以百普素(德国 Milupa GmbH公司)灌胃治疗；所有组幼鼠均等热、等氮治疗，保证热量610 kJ·kg-1·d-1，氮量1.0 g/d；所有组幼鼠于实验第10天处死。

1.3观察指标 体重：于造模前、造模后1、5、10 d称量3次，取平均值作为当日BA幼鼠的体重；营养指标：血清总蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)于造模后10 d测量，取幼鼠静脉血，采用血生化仪测量；肠黏膜形态：造模后饲养10 d处死幼鼠，分离组织取小肠组织进行苏木素-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色，显微镜下观察小肠黏膜形态变化，采用显微测量尺测定黏膜厚度、腺隐窝深度、绒毛高度；造模10 d后进行细菌培养：取幼鼠肠系膜淋巴结组织，粉碎后与LB琼脂培养基培养，37 ℃培养48 h，观察菌落并计数。

1.4统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料比较采用t检验和重复测量的方差分析、LSD-q检验、Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1BA幼鼠模型不同时间点体重 造模成功后，各组幼鼠的体重均先减轻后增长，与假手术组比较，抗生素组、EN组和PN组体重减轻后增长的较为缓慢，4组组间、时点间、组间与时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同组别BA幼鼠不同时间点体重比较

2.2BA幼鼠模型营养状态 治疗10 d后，与假手术组比较，抗生素组和PN组TP、ALB水平下降，与PN组、抗生素组比较，EN组TP、ALB水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同组别BA幼鼠营养状况比较

2.3BA幼鼠模型肠黏膜形态 治疗10 d后，与假手术组比较，抗生素组和PN组黏膜厚度、腺隐窝深度、绒毛高度下降；与抗生素组比较，PN组黏膜厚度、腺隐窝深度、绒毛高度上升；与PN组、抗生素组比较，EN组黏膜厚度、腺隐窝深度、绒毛高度升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同组别幼鼠肠道黏膜厚度、腺隐窝深度、绒毛高度比较

2.4BA幼鼠模型肠道微生态分析 治疗10 d后，与假手术组比较，抗生素组和PN组大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌数量升高，与抗生素组和PN组比较，EN组大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌数量下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同组别幼鼠肠道细菌培养比较

3 讨 论

BA是新生儿梗阻性黄疸的主要原因之一，为小儿最常见的严重肝胆外科疾病，早期手术治疗改善梗阻情况及手术方式的改良、术后常规给予抗生素、类固醇药物等均是以延长BA患儿生存期、减少术后并发症为目的[2,5]。胆管炎是BA患儿kasai术后最主要的并发症。目前胆管炎的发生主要与胆汁淤积及排泄障碍、肠道微生物迁移及患儿免疫功能下降有关，可能机制是kasai术后胆汁排泄障碍，胆汁在肝内外淤积，细菌通过血液和淋巴液循环到达吻合口及肝内时，淤积的胆汁使得细菌更为顺利地定植并繁殖，从而诱发胆管炎的发生[6-8]。引发胆管炎的致病菌多为肠道菌群，以大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌等革兰阴性杆菌为主。肠道黏膜功能受损易引起菌群失调及菌群的迁移，这些变化可触发胆管炎的发生[9-11]。BA患儿常伴有营养不良、免疫力低下和发育迟滞，术后消化道功能异常可进一步加重营养吸收障碍、免疫功能低下，从而加重细菌迁移感染的易感性，这些因素都与术后不良预后相关。美国危重症协会和美国肠外与肠内营养学协会指南中建议胃肠道术后应早期(术后24～48 h)进行EN治疗，对早期恢复术后消化道功能具有重要意义[5,11]。

对于BA幼鼠，同样常伴有营养不良、肠屏障功能障碍、免疫功能低下等状况，这些状况易引起肠道细菌移位，甚至发生肠源性感染。在大鼠胆总管结扎的BA模型中，肠道呈水肿和炎症性病变，可形成肠上皮间隙，肠黏膜紧密连接降低，分泌性免疫蛋白下降，黏膜上细菌附着增加，营养吸收障碍，这些均可诱导肠道炎症，进而诱发BA术后胆管炎发生[7]。既往动物实验研究提示高脂EN可减轻腹膜空气暴露后肠黏膜屏障损伤，其机制可能与其抗氧化作用有关[12]。亦有研究指出在大鼠肠缺血/再灌注损伤模型中，富含脂质的肠内营养可以控制肠道炎症，改善肠道运动和黏膜屏障损伤[13]。但EN治疗能否改善BA幼鼠模型伴发的肠道屏障功能障碍、营养不良等病变目前尚无动物实验研究。本研究通过分析早期EN治疗对BA幼鼠肠黏膜结构改善及微生态保护方面的作用，本研究显示，BA造模成功后，与假手术组比较，BA幼鼠模型术后体重明显下降，营养状况更差，肠黏膜损害严重(黏膜厚度、腺隐窝深度、绒毛高度下降)，肠道菌群感染增多，考虑BA易引起肠道黏膜结构稀疏，造成膜屏障的损害，可促进细菌移位及大量繁殖，这些变化与既往BA幼鼠模型较为一致[8]。既往研究提示，短期预防性静脉注射抗生素可能导致早期胆管炎，这可能导致较高的胆管炎发生率[11]。在本研究中，与PN组比较，抗生素组肠道黏膜功能下降，肠道致病菌群稍升高，考虑长时间抗生素治疗可引起肠道菌群紊乱，PN营养治疗可能改善肠道黏膜屏障和调节肠道菌群有关。

本研究结果显示，与抗生素组和PN组比较，EN治疗能够明显改善BA幼鼠TP、ALB等营养状态指标，明显增加幼鼠体重。在改善肠道黏膜结构方面，BA组动物肠黏膜厚度、腺隐窝深度、绒毛高度水平均有明显升高，这些改变可能与早期EN治疗刺激胃肠激素合成和释放，有利于肠道营养吸收，促进肠蠕动和黏膜增生，维持黏膜完整性，利于营养物质吸收有关[12-13]。可见，肠内营养制剂在改善BA幼鼠肠道黏膜结构、功能和营养状况方面发挥着重要作用。

微生态在BA幼鼠的肠道功能维持中亦发挥着中重要作用，细菌迁移可引起肠道菌群失调，参与了BA幼鼠kasai术后并发症的发生[14-15]。本研究分析显示，与抗生素组和PN组比较，EN组大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌数量明显下降，提示EN治疗能够有效抑制大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌等致病菌的繁殖，EN治疗抑制致病菌繁殖的原因可能是由于EN治疗改善了BA幼鼠的营养状态，通过有效地营养免疫调节作用稳定了肠道微生态，使肠道菌群维持平衡。有学者通过人群试验研究结果显示，早期EN支持可以有效降低肠道黏膜损伤程度，调节肠道菌群失衡，降低感染及死亡风险[16]。另有研究证明，EN治疗的胰腺炎患者肠道中的乳酸杆菌、双歧杆菌水平明显高于对照组[17]。上述研究均表明EN治疗在抑制致病菌、增加有益菌方面起到了重要作用。本研究尚未对幼鼠肠道营养治疗后的炎性指标检测，由于抗生素治疗可能对其炎性指标的影响，尚未对组间的炎性指标进行分析，今后会进一步分析早期EN治疗对BA幼鼠的炎性指标的影响，为指导BA的治疗提供重要参考依据。目前只是初步评价早期肠内营养治疗对BA小鼠的肠道微生态研究，尚未对肠黏膜屏障分子的检测，今后需进一步检测肠道组织中GFAP、S100β、ZO-1、claudin-1等肠黏膜相关指标，更为精准判断早期肠内营养治疗的疗效。

综上所述，对于BA幼鼠，EN治疗能够有效改善胃肠道黏膜结构、功能，有效改善BA幼鼠营养状况，稳定肠道微生态，为EN治疗BA患儿提供了重要的参考依据。