血清膜联蛋白A2与口腔鳞癌病人放化疗敏感性及预后的关系

曾雅婕，蒋柳宏，赵波，李轶

口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）作为多发性口腔恶性肿瘤，其发病率约占90%以上，占全身恶性肿瘤的1.5%～5.6%［1］。OSCC在舌、牙龈、颊、腭、上颌窦等部位多发，具有高发病率与高死亡率，易发生颈部淋巴结转移，5年生存率低于50%，晚期病人存活率低于30%，而影响OSCC治疗效果及预后的因素尚不明确［2-3］。膜联蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）是一种跨膜蛋白，参与DNA损伤修复、调节细胞凋亡及生长因子信号传导等生理过程，同时还与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关［4-5］。有多个研究发现ANXA2在癌症病人组织和血清中高表达，并可作为预后检测指标，而关于ANXA2在OSCC血清中表达情况研究较少［6］。因此，本研究旨在探讨中晚期OSCC病人血清ANXA2表达及与放化疗敏感性和预后的关系，为OSCC寻找新的预后检测指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料采用优效性检验计算确定样本量，取α=0.05为检验水准，把握度取80%，结合既往文献及研究，SPASS软件确定每组需样本量68例。选取2013年2月至2015年2月广州中医药大学第一附属医院收治的81例中晚期OSCC病人，排除13例不符合条件病人，以68例中晚期OSCC病人作为研究对象，同时选取68例体检健康者作为对照组。纳入标准：（1）经组织病理学确诊为中晚期OSCC病人（标准：①肿瘤细胞具有鳞状细胞的特点，有角化，形成角化珠；②具有细胞间桥；③肿瘤细胞有明显的异型性，可见核分裂象；④肿瘤细胞呈蟹足状浸润性生长，与正常组织之间没有界限）；（2）手术不耐受病人；（3）病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。排除标准：（1）预计生存期低于3个月者；（2）入组前有放化疗史者；（3）合并其他恶性肿瘤者；（4）合并糖尿病、高血压等慢性代谢障碍疾病者；（5）血小板凝集障碍者；（6）合并类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫障碍疾病者；（7）放化疗禁忌证者；（8）依从性差者。

1.2 放化疗方法采用直线加速器放疗，放疗60～66 Gy，每次剂量1.8～2.0 Gy，1次/天，5次/周，连续放疗6周。在放疗基础上给予顺铂（江苏豪森药业股份有限公司，批号H20010743，规格20 mg/20 mL）75 mg/m2，连续2 d，加入到250 mL 0.9%生理盐水中，静脉滴注1 h，氟尿嘧啶（通化茂祥制药有限公司，批号H22023469，规格0.25 g/10 mL）1 000 mg/m2，连续5 d，加入到500 mL 0.9%生理盐水中，静脉滴注，3周1个疗程，化疗2个疗程。治疗后出现恶心、呕吐48例，白细胞降低65例，放射线皮疹32例。

1.3 检测方法采集受试者静脉血3 mL，室温静止30 min，3 200 r/min离心10 min，取上清，-80℃冻存待检。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清ANXA2水平，试剂盒购自美国R&D公司，具体步骤如下：（1）设置标准品孔、待测样品孔与空白孔，相应孔中加标准品、待测样品，空白孔不加，37℃孵育30 min；（2）洗板：弃液，吸水纸上拍干，加洗涤液静止1 min，弃液，吸水纸上拍干，重复洗涤3次；（3）加酶标工作液：各孔加酶标工作液，空白孔除外，37℃孵育30 min；（4）洗板：弃液，吸水纸上拍干，加洗涤液静止1 min，弃液，吸水纸上拍干，重复洗涤3次；（5）显色：各孔加入显色剂A与显色剂B，混匀，37℃避光显色10 min；（6）终止：各孔加终止液终止反应；（6）测定：450 nm波长测定OD值，绘制标准曲线，计算待检样品浓度。

1.4 疗效评定标准疗效评定参照世界卫生组织（WHO）实体瘤疗效评价标准［7］，完全缓解（CR）：肿瘤病灶完全消失，持续4周以上无复发；部分缓解（PR）：各病灶最大直径与垂直直径乘积消退≥50%；稳定（SD）：各病灶最大直径与垂直直径乘积消退＜50%或增大≤25%；进展（PD）：各病灶最大直径与垂直直径乘积增大＞25%或有新病灶出现，总有效率=（完全缓解+部分缓解）/总例数×100%。

1.5 统计学方法本研究所得的实验数据均采用SPSS 20.0，其中符合正态分布的计量资料用描述，并用t检验；计数资料用例（%）描述，并用χ2检验；OSCC病人血清ANXA2低表达与高表达的生存曲线采用Kaplan-Meier法衡量，得到各组5年中位数生存时间并比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者临床资料比较两组性别、年龄以及BMI比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 中晚期口腔磷癌（OSCC）病人68例与体检健康者68例临床资料比较

2.2 两组病人血清ANXA2水平比较研究组病人血清ANXA2水平（28.15±6.24）μg/L明显高于对照组（13.92±4.18）μg/L（t=15.62，P＜0.05）。

2.3 ANXA2表达与临床病理参数关系以OSCC病人血清ANXA2表达中位数（27.62）为界值将OSCC病人分为ANXA2高表达组和ANXA2低表达组。血清ANXA2表达与病人年龄、性别、肿瘤大小无关（P＞0.05），与病人TNM分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移相关（P＜0.05），见表2。

表2 口腔磷癌（OSCC）病人68例血清膜联蛋白A2（ANXA2）表达与临床病理参数关系/例

2.4 ANXA2表达与放化疗疗效关系ANXA2高表达组病人放化疗总有效率为54.84%（17/31），ANXA2低表达组病人总有效率为78.38%（29/37），两组病人放化疗总有效率比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 膜联蛋白A2（ANXA2）表达与放化疗疗效关系

2.5 OSCC病人血清ANXA2表达与预后关系OSCC病人血清ANXA2低表达病人随访5年中位数生存时间为（37.00±5.28）个月，高表达组5年中位数生存时间为（28.00±3.89）个月，两组病人预后5年中位数生存时间比较差异有统计学意义（t=7.87，P＜0.001）。

3 讨论

OSCC是世界十大恶性肿瘤疾病之一，全球每年约有500 000新增病例，OSCC高发于45～75岁人群，并随着人口老龄化加剧，其发病率呈明显升高趋势［8-9］。目前研究认为咀嚼槟榔、吸烟酗酒、不良修复体刺激及人乳头瘤病毒感染等是OSCC致病因素［10］。随着手术治疗、放化疗技术及检测技术不断进步，OSCC死亡率有所下降，但OSCC早期病人预后良好，5年生存率可达85%以上，但多数病人确诊已为中晚期，预后较差，严重影响病人生活质量及生命健康［11］。因此，本研究希望通过对OSCC病人血清ANXA2水平检测及与放化疗敏感性关系分析，为OSCC治疗和预后提供新的检测指标。

ANXA2属于跨膜蛋白A家族重要成员之一，是一种外分泌钙磷脂结合蛋白，主要分布于细胞膜与细胞浆中，可在单核细胞、内皮细胞及多种肿瘤细胞中表达，并能释放入血在外周血中检测到。ANXA2在多种肿瘤组织、血清中异常升高，并与肿瘤侵袭、迁移、分化及药物抵抗等存在密切联系，可用于早期诊断多种恶性肿瘤及评估预后的参考指标［12］。研究发现，ANXA2在肝细胞癌组织中高表达，并与肿瘤长径、浸润转移相关，参与肝细胞癌发生、发展［13］。有研究证实ANXA2在乳腺癌血清中表达上调，其表达上调是整体生存率差和远处无转移生存预后的独立指标［14］。本研究结果显示，研究组病人血清ANXA2水平明显高于对照组，Zhang等［15］临床研究显示相较于良性口腔疾病组和健康对照组，OSCC病人ANXA2水平明显升高，与本研究结果相一致，进一步表明ANXA2在OSCC中呈高表达水平，推测与疾病发生发展关系密切。结果还显示OSCC病 人血 清ANXA2表 达与TNM分期、分 化程度、淋巴结转移、远处转移相关，而与年龄、性别、肿瘤大小无关，同于洋等［16］研究结果基本相似，提示ANXA2参与OSCC疾病发生、发展。有研究发现ANXA2沉默可抑制血管生成，而血管生成是肿瘤发生的重要因素，细胞表面上的ANXA2可与血管产生抑制因子特异性结合，使纤维蛋白溶解酶与ANXA2结合受阻，无法形成纤溶酶，影响血管生成，ANXA2还能将基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）前体活化，而MMP-2和MMP-9可降解细胞基质，促进肿瘤细胞侵袭与迁移［17-18］。本研究中ANXA2表达与肿瘤大小无关，可能是由于样本量较少，造成结果偏倚所致。进一步通过对ANXA2不同表达水平OSCC病人放化疗敏感性分析显示，ANXA2高表达组病人放疗总有效率为54.84%，明显低于ANXA2低表达组病人总有效率的78.38%，与Chen等［19］研究结果相似，提示血清ANXA2高表达OSCC病人对放化疗敏感性低，放化疗效果差。有研究报道癌症病人进行放射治疗者，ANXA2可进入细胞核内以减轻放射对DNA损伤，起到保护DNA作用，而ANXA2如何保护DNA机制尚不清楚［20］。最后通过生存曲线分析显示，OSCC病人血清ANXA2低表达病人5年中位数生存时间与高表达组比较差异有统计学意义，与Liu等［21］研究结果基本相似，提示OSCC病人的ANXA2水平越高，则生存时间越短，预后较差，其可作为预测OSCC预后潜在生物学指标。

综上所述，中晚期OSCC病人血清ANXA2高表达，并与TNM分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移相关，且ANXA2高表达者的放化疗敏感性低，生存时间短。但本研究可能因所选研究对象及随访时间有限，可能对研究结果产生一定误差，在之后进一步对OSCC机制研究中会着重改进。