高效液相色谱法检测七味都气丸中活性成分五味子醇甲、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B的含量

张宪

七味都气丸是由醋五味子、山茱萸、泽泻、牡丹皮、熟地黄、茯苓、山药七味药材，经粉碎、过筛、制丸、干燥等工序制成的中药丸剂品种，该产品具有补肾纳气、涩精止遗等功效，临床主要用于治疗肾不纳气所致喘促、胸闷、久咳、气短、咽干、遗精、盗汗、小便频数等病症［1-2］。方中醋五味子药材有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效［3-5］，山茱萸药材有补益肝肾、收涩固脱等功效［6-8］，泽泻药材有利水渗湿、泄热、化浊降脂等功效［9-12］。七味都气丸临床应用较为广泛，先收载于《中国药典》2015年版中，但其质量控制方法中仅针对五味子醇甲进行含量测定［13］，不能更好地体现该产品的整体质量水平，为保障广大病症病人的用药安全，林芳等［14］通过五味子醇甲含量测定建立了七味都气丸的质量控制方法，胡晓炜通过五味子酯甲、五味子甲素含量测定建立了七味都气丸的质量控制方法［15］，上述学者均采用控制五味子药材活性成分含量建立质控方法，研究药材种类单一，没有将该产品中起功能作用的主药成分进行含量测定。本研究于2019年3月至2022年5月进行，针对该产品中的起功能作用的药材五味子、山茱萸和泽泻，研究开发高效液相色谱法检测七味都气丸中活性成分五味子醇甲、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B含量的分析方法［16-19］。现报告如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1200型高效液相色谱仪（配备自动进样器、四元泵、二极管阵列检测器（PDA）、柱温箱等，安捷伦科技公司）；Waters X-bridge C18色谱柱（沃特世科技公司）；Sartorious Quintix224-1CN型电子天平（赛多利斯科技公司）；HY-CXJ型数控超声波清洗器（长沙汇一仪器公司）；Milli-Q Advantage A10型纯水仪（密理博科技公司）。

1.2 试药对照品：五味子醇甲（批号110857-201815，含量99.7%）；马钱苷（批号111640-201808，含量99.0%）；23-乙酰泽泻B（批号111846-201705，含量99.7%），均购于中国食品药品检定研究院；七味都气丸［泉州中侨（集团）股份有限公司药业公司，批号20181214、20190112、20190506，规格为每40丸重3 g］；甲醇、乙腈为色谱纯（美国TEDIA公司）；磷酸为分析纯（国药集团化学试剂厂）；纯化水为自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Waters X-bridge C18液相色谱柱（规格250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.3%磷酸溶液（取3.0 mL浓磷酸，加水至1 000 mL，混匀，超声脱气），梯度洗脱 ，洗 脱 程 序 为 ：0～7 min 8%A，7～18 min 8%～60%A，18～28 min 60%～91%A，28～30 min 91%～8%A，30～35min 8%A；流 速 ：1.0 mL/min；柱 温 ：30℃；进样体积：25 μL；检测波长：228 nm。

2.2 溶液配制对照品储备溶液：取五味子醇甲25.08 mg、马钱苷25.25 mg、23-乙酰泽泻醇B 25.08 mg，精密称定，置同一支25 mL容量瓶中，加20 mL 90%甲醇溶液使溶解并定容至刻度，摇匀。

对照品溶液：精密量取对照品储备溶液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加90%甲醇溶液定容，摇匀。

供试品溶液：取七味都气丸样品15 g，研细，65目筛网筛过；精密称取细粉1.0 g，置20 mL容量瓶中，加90%甲醇溶液约12 mL，超声提取30 min（功率240 W，频率45 kHz），放冷，加90%甲醇溶液定容，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。

试剂空白溶液：除不加样品外，其余步骤按供试品溶液处理方法进行，制备试剂空白溶液。

阴性供试品溶液：按七味都气丸制备方法和药材配比比例，制备缺醋五味子、山茱萸和泽泻的阴性样品，阴性供试品按供试品溶液配制方法进行前处理，得阴性供试品溶液。

2.3 方法学考察专属性试验：取“2.2”项下供试品溶液、试剂空白溶液、对照品溶液和阴性供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别上机分析，采集色谱图；结果马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B在该色谱条件下分离度均大于1.5，理论塔板数大于5 000，拖尾因子为0.95～1.05，且阴性供试品溶液中无干扰峰。典型谱图见图1

线性关系考察：取“2.2”项下对照品储备溶液适量，制备含马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B质量浓度依次为：0.2 mg/L、0.4 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L和20.0 mg/L的标准曲线溶液，加90%甲醇溶液定容至刻度，摇匀；按“2.1”项下色谱条件分别上机分析，采集色谱图。以峰面积为纵坐标、对应的质量浓度为横坐标进行线性回归，结果三种成分在质量浓度为0.2～20.0 mg/L范围内，均具有良好的线性。见表1。

表1 三种成分线性方程、范围及相关系数

精密度试验：取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件上机分析，连续进样6针，采集色谱图；按三种成分峰面积计算相对标准偏差（RSD）；结果马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B峰面积RSD分别为：1.1%、1.2%和0.98%，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取七味都气丸样品，按“2.2”项下供试品溶液进行前处理，得供试品溶液，同法同一批供试品共配制6份；按“2.1”项下色谱条件分别上机分析，采集色谱图，分别计算三种成分的含量，根据6次检测结果计算RSD。结果马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B含量RSD分别为：1.7%、2.1%和1.4%，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取七味都气丸样品，按“2.2”项下供试品溶液进行前处理，得供试品溶液；室温下分别放置0 h，3 h，6 h，9 h，12 h，18 h，24 h，每个时间点取样1次，分别上机分析，采集色谱图。结果马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B峰面积RSD分别为：1.4%、1.8%和1.6%，表明在室温下24 h内供试品溶液稳定。

加标回收试验：取已测定含量的七味都气丸样品，研钵研成细粉，65目筛网筛过；取细粉1.0 g，精密称定，置20 mL容量瓶中，分别加入“2.2”项下对照品储备溶液一定量，后续按供试品溶液处理，共制备6份加标溶液；按“2.1”项下色谱条件分别上机分析，采集色谱图，计算马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B加标回收率。见表2

表2 样品加标回收率结果

2.4 市售样品含量测定取市售七味都气丸样品，按“2.2”项下供试品溶液进行前处理，得供试品溶液；按“2.1”项下色谱条件分别上机分析，采集色谱图，根据峰面积计算马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B的含量。见表3

表3 样品含量检测结果

3 讨论

3.1 检测方法的选择实验选择的三种待测成分，马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B，均具有强烈的紫外吸收，因此可以选择分光光度法和液相色谱法进行含量测定。分光光度法由于专属性较差，且易受到基质干扰导致准确度偏低，尤其对于多组分同时测定，检测效率偏低；高效液相色谱法具有专属性好，尤其对于多组分的测定，采用二极管阵列检测器，可以针对不同组分紫外吸收波长的不同，分别准确度定量检测。因此实验选择高效液相色谱法作为检测方法。

3.2 检测波长的选择取马钱苷对照品，加90%甲醇溶液制备含马钱苷质量浓度为10 mg/L的波长检查溶液同法配制五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B波长检查溶液；上述三种成分标准溶液，分别在200～400 nm波长范围内扫描；结果马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B分别在239 nm、250 nm和210 nm处有最大吸收，为使三种成分在2.1色谱条件下响应零号，故选择228 nm作为检测波长。

3.3 流动相的选择实验分别选择乙腈-水、乙腈-0.3%磷酸水溶液、甲醇-水和甲醇-0.3%磷酸水溶液作为流动相体系，考察上述4种体系对待测成分色谱行为的影响；按“2.1”项下色谱条件，保持其他条件不变，分别采用上述4种流动相体系，考察三种成分分离情况。结果，选择乙腈-0.3%磷酸水溶液作为流动相体系时，马钱苷、五味子醇甲和23-乙酰泽泻醇B分离度最佳，且阴性对照溶液无干扰。故实验选择乙腈-0.3%磷酸水溶液作为流动相体系。

综上所述，实验建立高效液相色谱法检测七味都气丸中活性成分五味子醇甲、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B含量的分析方法，考察了方法的稳定性、重复性、加样回收率等，确定了流动相体系和检测波长，实验结果证明，该方法具有前处理简单、测定效率高、结果准确等特点，可以用于七味都气丸品种的质量控制。