豆腐果苷对骨关节炎大鼠软骨和滑膜组织影响

郭南，贾元威，项婷，王萍，詹翠娇，王昌茂，沈杰，，杨斌

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节退化或老化作为病理基础，以关节肿胀、疼痛或功能障碍作为主要临床表现的一类关节炎性疾病［1-3］，近年来骨关节炎发病也见于青少年［4］。目前临床尚无满意的治疗方法，临床治疗为减轻炎性症状和改善功能状态，常用药物有止痛药、非甾体抗炎药、肾上腺皮质激素［5］等，长期应用会导致胃肠道不良反应和代谢紊乱等副作用。青少年病人急需一种具有明确疗效且副作用小的治疗药物。

豆腐果苷（图1，helicid，对甲醛苯-O-β-D-阿咯吡喃糖苷）提取自山龙眼科山龙眼属植物深绿山龙眼果实，是此种属植物来源唯一已上市成功应用于临床的酚苷类物质［6］。毒理学研究表明，27 mg·kg-1·d-1、270 mg·kg-1·d-1、1 350 mg·kg-1·d-1剂量母体染毒对大鼠仔代的早期生理发育及中枢神经系统的发育没有影响［7］。文献报道，口服豆腐果苷在6.25～50.00 mg/kg范围内的镇痛作用呈剂量依赖性。本课题组前期基于豆腐果苷抗骨关节炎模型（OA模型）大鼠疼痛的药效学研究发现，给予25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg剂量豆腐果苷21 d后，均可使骨关节炎模型大鼠的机械痛阈值上升，药效学行为呈现钟形曲线，50 mg/kg剂量组升高机械痛值阈值作用最强［8］。因此本研究选择50 mg/kg豆腐果苷作为给药剂量。

图1 豆腐果苷分子结构式

采用膝关节注射一定浓度碘乙酸钠可快速建立稳定、高效的OA大鼠模型，且大鼠病理表现与关节炎患者临床表现相似，包括关节疼痛、间歇性炎症和关节神经损伤。这种方法是研究骨关节炎的经典可靠模型［9-10］。

本研究旨在首次探讨对骨关节炎模型大鼠具有明确镇痛作用的豆腐果苷50 mg/kg剂量给药后，大鼠膝关节滑膜和软骨的病理变化。本研究分别采用HE染色与番红固绿染色分别对大鼠软骨和滑膜进行染色观察，并分别进行相应的评分鉴定，以定量评价豆腐果苷对大鼠骨关节炎的影响。

1 材料与方法

1.1 材料健康雄性SD大鼠共24只［上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2018-0004］，SPF级，体质量（180±20）g。恒温（22±2）℃，12 h光照/黑暗循环条件下自由饮水饮食适应性饲养1周后，开展动物实验。本研究所有动物实验操作均符合一般动物实验伦理学原则。研究起止时间为2019年12月至2020年7月。

1.2 药品与试剂豆腐果苷（TCI Japan公司，纯度＞98%，批号QCCYK-GS）；碘乙酸钠（Sigma-Aldrich，≥98%，批号SLBZ7569）；苏木素染色液（无锡市江原实业技贸总公司，批号200423）；番红染色液和固绿染色液（Sigma公司）；伊红染色液（无锡市江原实业技贸总公司，批号200609）。

1.3 主要仪器荧光倒置显微镜（T8 TOKYO，Nikon公司，JAPAN）；切片机（型号LEICA 2245，Germany）；精密电子天平（AL104-IC，METTLER TOLEDO）；数显游标卡尺（杭州钢拓工具有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 骨关节炎大鼠模型 结合相关研究提及的大鼠骨关节炎造模方法进行造模［11-12］。操作过程大致为，使用10%水合氯醛（3 mL/kg，ip）对大鼠进行麻醉；直至大鼠所有感觉反射停止，对左右膝关节进行剃毛，医用碘伏消毒后用75%乙醇脱碘2次；膝关节屈曲45°，自髌骨下韧带外侧进行关节腔穿刺，进针到股骨髁后稍微回退，一次性膝关节腔注射50 μL碘乙酸钠（0.9%灭菌生理盐水配制，浓度为3 mg/50 μL）；将大鼠膝盖伸展和弯曲30 s，使碘乙酸钠溶液分散至整个膝关节处。同时，假手术组对大鼠膝关节注射等量生理盐水。

1.4.2 分组和给药 造模成功后，将假手术大鼠分为一组，骨关节炎模型大鼠随机区组分组法分为模型组和50 mg/kg豆腐果苷治疗组，每组8只。豆腐果苷给药方法：大鼠禁食12 h，造模前1天开始于上午7：30～8：30以50 mg/kg剂量豆腐果苷溶液灌胃大鼠，模型组和假手术组分别给予等量生理盐水灌胃。灌胃每天1次，持续21 d。

1.4.3 膝关节标本收集、制备、观察 给药21 d后，使用1%戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，并颈椎脱臼法处死大鼠。固定大鼠后，分离右侧膝关节皮肤及皮下组织，剔除周围的肌肉组织，保留股骨远1/4和胫骨近端1/4截取整个大鼠膝关节，并于4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上。固定后的大鼠膝关节用15%EDTA脱钙4周后，进行石蜡包埋，切片，以及HE和番红固绿染色分别观察与评价软骨和滑膜病理变化。本研究在2月龄青年期大鼠体内开展，此月龄大鼠发育不完全，潮线尚不清晰［13-14］，所以在评价时采用改良的Mankin评分，潮线完整性和清晰度不计入评分。

1.4.3.1 HE染色评价 荧光倒置显微镜下观察关节软骨、滑膜形态，分别对假手术组、模型组及豆腐果苷给药组滑膜组织病理学进行鉴定评分。（1）滑膜组织病理评分［15］。炎细胞：0分，无；1分，稀疏、散在；2分，较密集；3分，大量。（2）纤维组织增生：0分，无；1分，少量增生；2分，中等；3分，大量。（3）滑膜组织增生：0分，无；1分，单层；2分，2层；3分，3层。（4）巨噬细胞增生：0分，无；1分，稀疏；2分，较密集；3分，大量。

1.4.3.2 Mankin评分 荧光倒置显微镜下观察大鼠膝关节软骨与软骨下骨和骨组织间关系。并对软骨病理变化进行Mankin评分［16］。评分标准［17］：（1）软骨结构：正常，0分；表面不规则，1分；血管翳，2分；血管翳和表面不规则，3分；到过渡带的裂隙，4分；到放射带的裂隙，5分；到钙化带的裂隙，6分。（2）软骨细胞：正常，0分；细胞形态固缩及脂质变性，1分；大量簇集样细胞团，1分；数量明显消失，3分。（3）番红固绿染色：正常，0分；轻度减少，1分；中度减少，2分；重度减少，3分；未着色，4分。（4）潮线完整性：完整，0分；被血管破坏，1分；总分14分。

1.5 统计学方法SPSS 19.0软件用于本实验数据的统计分析，采用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膝关节形态观察图2可见假手术组关节面色泽正常，关节表面光滑，未见关节肿胀及积液形成。模型组较之假手术组，关节软骨表面不规则，有溃疡形成，腔内出现积液。豆腐果苷组关节表面与模型组相比，关节软骨表面较完整，溃疡有较大改善，腔内未出现积液。我们通过对处死后大鼠，采用数显游标卡尺测量各组大鼠膝关节直径，研究各组大鼠膝关节的肿胀程度。如图2所示，可以清晰观察到豆腐果苷可显著缓解模型组关节肿胀。上述结果共同表明豆腐果苷可以减轻碘乙酸钠诱导的关节损伤。

2.2 各组大鼠膝关节软骨HE染色结果由图3中大鼠膝关节软骨HE染色结果可知，假手术组膝关节软骨表面光滑，且细胞排列规则，四层结构清晰，软骨基质染色均匀，未见炎细胞浸润。相对于假手术组，模型组大鼠膝关节软骨表面粗糙且有绒毛状，软骨细胞排列紊乱，软骨基质染色不均，部分区域的细胞核固缩、坏死，有炎性细胞浸润和血管生成。但是在给予豆腐果苷治疗后，大鼠软骨表面较完整，软骨基质染色较均匀，四层结构较清晰，细胞排列较整齐。结果表明豆腐果苷可以减轻碘乙酸钠导致的大鼠关节软骨组织病变。

2.3 各组大鼠膝关节滑膜HE染色结果图4中大鼠膝关节滑膜HE染色结果显示，假手术组可见大量的脂肪细胞和滑膜细胞；模型组较假手术组表现出更多的炎性细胞浸润，滑膜组织明显增厚，有散在的炎性细胞如淋巴细胞出现。但豆腐果苷组炎性细胞明显减少，部分可见脂肪细胞和增生的血管。结果表明豆腐果苷可以减轻碘乙酸钠诱导的炎性细胞增加。

2.4 各组大鼠滑膜组织病理评分结果对各组大鼠的滑膜组织病理特征进行评分可得，模型组大鼠的评分相对于假手术组显著增大［（6.88±0.83）比（0.50±0.53）］（P＜0.01），在灌胃50 mg/kg豆腐果苷21 d后，大鼠的滑膜病理评分显著降低［（3.50±0.53）比（6.88±0.83）］（P＜0.01）。以上数据表明50 mg/kg的豆腐果苷可以显著改善骨关节炎大鼠的滑膜病理损伤。

2.5 各组大鼠膝关节软骨番红固绿染色结果如图5，由大鼠膝关节软骨的番红固绿染色图可观察到，假手术组软骨细胞的细胞核呈粉红色，细胞质呈蓝绿色，其软骨细胞形态结果与HE染色结果基本相同，且软骨基质完整，染色均匀，无蛋白多糖丢失。而模型组番红显色明显降低，软骨基质分布不均匀，蛋白多糖丢失明显。在给予豆腐果苷治疗后，软骨较模型组基质分布均匀，蛋白多糖丢失有显著改善，表明豆腐果苷可以改善大鼠膝关节软骨损伤。

2.6 各组大鼠膝关节软骨Mankin评分结果豆腐果苷以50 mg/kg剂量灌胃大鼠21 d后的膝关节软骨Mankin评分结果如表1所示。数据显示，较假手术组，模型组大鼠膝关节软骨结构、软骨细胞和番红固绿染色Mankin评分值均显著上升（P＜0.01），而在豆腐果苷干预后，各项指标评分值较模型组均有显著下降，以上数据提示豆腐果苷50 mg/kg可以减轻碘乙酸钠诱导的青年大鼠膝关节病变程度。

表1 各组大鼠膝关节Mankin评分比较/（分，）

表1 各组大鼠膝关节Mankin评分比较/（分，）

注：①与假手术组比较，P＜0.01。②与模型组比较，P＜0.05。

组别假手术组模型组豆腐果苷组F值P值关节数888 Mankin评分软骨结构0.50±0.53 3.88±0.83①1.63±0.52②64.67＜0.001软骨细胞0.25±0.46 1.75±0.46①1.13±0.64②37.56＜0.001番红固绿染色0.38±0.52 2.38±0.74①0.88±0.64②52.43＜0.001

3 讨论

骨关节炎是较为常见的关节疾病，影响全球约2.4亿人，伴有极高的发病率和死亡率，可导致残疾，严重降低了病人的生活水平［18-19］，并存在一定数量的青少年病人。进行性、不可逆的软骨退化是骨关节炎标志病理特征之一，并且与滑膜、软骨下骨和半月板及其他关节组织的病理发展密切相关［20］。向大鼠膝关节定量注射碘乙酸钠建立OA模型是药理学当中研究骨关节炎的经典方法。本研究的重点是探讨豆腐果苷对碘乙酸钠诱导的大鼠OA模型软骨和滑膜组织的影响。与模型组大鼠相比，豆腐果苷可明显减轻膝关节肿胀程度，改善关节软骨组织形态，并且减少了软骨基质中蛋白多糖的丢失，以及抑制了膝关节滑膜组织增厚和炎症细胞的增加。其原因可能与豆腐果苷的抗炎、镇痛机制有关，后续将开展系列研究，进一步探索豆腐果苷减轻滑膜炎症、保护软骨的作用机制。

在OA的治疗药物中目前最常见的为非甾体类抗炎药、对乙酰氨基酚等［21］，但因其长期给药有严重的不良反应，限制了其使用。目前，对OA治疗方法的研究表明天然产物及其衍生物具有一定的潜力，如附子［22］等。豆腐果苷在止痛、镇静、抗抑郁、心脑血管系统疾病及各种衍生物的研究等方面都有一定的疗效，且毒副作用低，可长期使用［23］。或许可与非甾体抗炎药联合使用或交替使用，以加强疗效降低毒副作用，但还有待实验进一步证实。

此外有研究表明，豆腐果苷结构类似物天麻素（gastrodin，对羟甲基苯-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）可通过抑制OA大鼠软骨退化而抑制OA进程。本研究结果也显示豆腐果苷可抑制OA大鼠软骨退化。我们猜想，其发挥作用的机制是否与天麻素相似，即通过抑制核转录因子NF-κB途径，减少炎性因子，包括IL-6，TNF-α等的释放来发挥抗炎作用［24］，这有待进一步研究。据报道，豆腐果苷及其代谢产物与天麻素有很多相似药效学作用，对此类具有明确药效作用且不良反应极少的天然产物的深入研究，是发现新的天然产物及新的作用靶标与通路的重要途径。

综上，豆腐果苷可显著改善碘乙酸钠诱导的骨关节炎大鼠膝关节滑膜和软骨的病理损伤。本研究为豆腐果苷应用于软骨病变和滑膜炎的临床防治提供了一定的理论基础。此外，本课题组在研究结果的基础上还将对豆腐果苷发挥骨关节炎治疗作用的具体分子机制进一步研究。