高效液相色谱-电雾式检测器法测定尿素乳膏含量

柳冬梅，赵慧

尿素是一种极性小分子，由二氧化碳和液氮经化学反应后脱水而制得，又称为碳酰胺或脲，具有较强的末端紫外吸收［1］。

泰州市中医院的尿素乳膏质量标准和2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称中国药典）均采用显色后紫外-可见分光光度法，具有重现性差，操作繁琐及不适合批量分析等问题［2］。因此，有必要开发一种新方法用于测定尿素乳膏的含量，解决现有标准方法的可操作性及重现性等问题。查阅文献发现目前尿素乳膏的测定方法主要有电位滴定法，紫外-可见分光光度法及高效液相色谱法（HPLC）［3-5］。其中HPLC大多选用氨基柱和紫外检测器进行测定，存在灵敏度低，色谱柱消耗大，检测成本高等问题［6-8］。电雾式检测器（CAD）响应信号依赖于被测物的绝对质量，可用于分析各种半挥发性或不挥发性的酸性、碱性、中性、非极性及极性的两性离子［9-19］。

本研究起止时间为2019年5月至2020年3月，通过建立HPLC-CAD法测定尿素乳膏的含量，新建的方法具有操作简单，准确性好，灵敏度高，专属性强等特点，可为尿素乳膏的质量控制提供新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药高效液相色谱仪（型号UltiMate 3000，美国Thermo Fisher Scientific公司）、CAD（型号CoronaVeo SD，美国Thermo Fisher Scientific公司），电子天平（型号XPR-225，瑞士Mettler公司）

15%的尿素乳膏（泰州市中医院，批号20190125、20181220、20181101，规格15%）；尿素对照品（中国食品药品检定研究院，批号100288-201302）；乙腈（色谱纯，Merck公司）；乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水均由Milli-Q纯水系统制备。

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件 采用Waters XBridge Amide酰胺色谱柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；水-乙腈（10∶90）为流动相；柱温为35℃；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；CAD参数设置：雾化温度为35℃，幂率为0.9，过滤常数为10 s，采集频率为10 Hz。

1.2.2 溶液制备 精密称取尿素对照品25 mg，置量瓶中，加乙醇适量，超声使其完全溶解后，用乙醇稀释使成浓度为每毫升中约含1 mg尿素的溶液，摇匀，作为储备液。

精密量取储备液适量，分别用乙醇定量稀释制成浓度为每毫升中约含0.5 mg、0.2 mg、0.1 mg、0.05 mg、0.02 mg、0.01 mg及0.005 mg尿素的溶液，作为系列浓度的标准曲线溶液。

称取尿素乳膏样品约1.3 g（约相当于尿素200 mg），精密称定，置100 mL量瓶中，加乙醇适量，于60℃的水浴中加热20 min使其完全溶解后，冷却至室温，用乙醇定容，摇匀，置冰浴中冷却，滤过，弃去初滤液；精密量取续滤液10 mL，置100 mL量瓶中，用乙醇定容，摇匀，作为供试品溶液。

精密量取储备液10 mL，置50 mL量瓶中，加乙醇定容，摇匀，作为对照品溶液。

根据泰州市中医院尿素乳膏的配方制备空白基质，精密称取空白基质1.3 g，置100 mL量瓶中，按照供试品溶液配制的方法，同法制备空白溶液。

1.2.3 系统适用性试验与破坏性试验 分别精密吸取空白溶液，尿素对照品溶液及尿素乳膏供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图（图1），结果表明，溶剂对尿素主峰无干扰，尿素乳膏基质中的辅料及其他成分对测定无干扰，理论塔板数按尿素色谱峰计算大于15 000。

图1 空白溶液（A）、供试品溶液（B）、对照品溶液（C）的高效液相色谱图

精密称取尿素对照品10 mg，5份，分别置20 mL量瓶中，加乙醇适量使其完全溶解，分别经过碱（0.1 mol/mL氢氧化钠）破坏，酸（0.1 mol/mL盐酸）破坏，光照（4 500 lx）破坏，氧化（30%过氧化氢）破坏及高温（水浴加热）破坏后，得到相应的破坏性溶液。

精密量取破坏溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图（图2）。结果表明，各破坏条件下产生的杂质峰对测定均无干扰，表明新建的方法分离效果好，专属性强。

图2 破坏性试验色谱图

1.2.4 线性与范围 精密吸取“1.2.2”项下系列标准曲线溶液各10 μL，依次注入液相色谱仪，进样分析并记录各色谱图。以尿素色谱峰峰面积（Y）作为纵坐标，浓度（X）作为横坐标，绘制线性标准曲线，线性回归方程：Y=2712X-13.726，r=0.999。结果表明尿素在0.005～0.5 g/L的浓度范围内呈现良好的线性关系。

1.2.5 进样精密度与重复性 精密吸取同一对照品溶液，连续进样6次进行测定。6次测定的主峰峰面积的相对标准差（RSD）为0.52%（n=6），结果表明该液相色谱仪的进样精密度良好。

分别精密称取尿素乳膏样品（批号20181220）6份，制备相应的供试品溶液，进样分析，测定尿素乳膏的含量。结果尿素含量为标示量的97.9%（n=6），RSD为0.91%（n=6），表明该方法的重复性良好。

1.2.6 定量限（LOQ）和检测限（LOD） 将“1.2.2”项下最低浓度的标准曲线溶液逐级稀释，并依次进样测定。按信噪比（S/N）=10计算，该方法测定尿素的定量限为5 ng；按S/N=3计算，该方法测定尿素的检测限为2.5 ng。

1.2.7 溶液的稳定性 取同一份尿素乳膏供试品溶液（批号20181220），分别在0 h、4 h、8 h和12 h进样分析，记录色谱图。结果主峰峰面积的RSD为0.53%。结果表明，供试品溶液在12 h内保持稳定。

1.2.8 回收率试验 称取空白基质各6份，精密称定，分别置100 mL量瓶中，再依次精密加入尿素对照品适量，制备6份供试品溶液。依次进样分析，计算回收率，见表1。

表1 回收率结果

1.2.9 耐用性 调节流动相中乙腈和水的比例，柱温及流速等参数，考察尿素色谱主峰的理论塔板数，对称因子及其与各杂质峰之间的分离情况。结果表明，尿素色谱峰的对称因子均小于1.2，且杂质对尿素测定无干扰，结果表明该方法耐用性良好。

1.2.10 样品测定 分别称取尿素乳膏样品和尿素对照品适量，制备尿素乳膏供试品溶液与对照品溶液，每批样品分别制备2份供试品溶液，每份分别进样2次，按外标法以峰面积计算尿素标示量的百分含量，批号20181101、20181220、20190125的三批次样品检测含量分别为95.6%、98.0%、92.5%，对应的RSD分别为0.38%、1.20%、0.41%。

2 讨论

2.1 色谱柱的选择本研究采用酰胺色谱柱进行尿素乳膏的研究分析。XBridge Amide色谱柱使用稳定的三键键合式的酰胺官能团作为键合相，其选择性与氨基柱相近，但是化学性质更加稳定，因此该色谱柱耐受性更强，稳定性更高，寿命更长，更适合于极性物质的分析［20］。

2.2 CAD的相关参数设置CAD影响信号响应的参数主要有三类：①采集频率和过滤常数。通过试验研究发现，采集频率和过滤常数的增大，色谱图中基线波动越小，同时色谱峰的平滑度也越好，通过试验比较最终设置采集频率和过滤常数分别为10 Hz和10 s。②雾化温度。CAD主要通过加热进行雾化，且待测物的信号响应与其雾化程度息息相关，因此试验分别考察55℃和35℃两种不同雾化温度对信号响应的影响。结果发现随着雾化温度的升高，尿素色谱峰的响应明显降低，不利于尿素的检测，最终选用35℃的雾化温度。③幂率。幂率是CAD特有的线性校正参数，不同类型的化合物具有不同的最优幂率，实验考察不同的幂率（0.8、0.9、1.0、1.1）对线性的影响，结果见表2。研究发现幂率为0.9时，尿素在0.005～0.500 g/L范围内的线性关系最佳。

表2 幂率（PFV）参数优化